1. Başlangyç düşünişmek

Bu etapda, garrylarymyzyň öňünde ýalňyşlyk goýbermezlik üçin käbir düşünjelere we terminologiýalara düşünmelidiris:

S: RT-PCR, qPCR, Real-PCR we real wagt RT-PCR arasynda näme tapawut bar?

Jogap: RT-PCR ters transkripsiýa PCR(ters transkripsiýa PCR, RT-PCR), polimeraza zynjyr reaksiýasynyň (PCR) giňden ulanylýan görnüşi.RT-PCR-de, RNK setiri goşmaça DNK-a tersine ýazylýar, soňra PCR tarapyndan DNK güýçlendirmek üçin şablon hökmünde ulanylýar.
Hakyky wagt-PCR we qPCR.

Real-wagt PCR (real wagt floresan mukdar PCR) we Ters transkripsiýa PCR (ters transkripsiýa PCR) RT-PCR diýip gysgaldylan ýaly görünse-de, halkara konwensiýa: RT-PCR tersine transkripsiýa degişlidirPCR, Real-wagt PCR köplenç gysgaldylýar qPCR (mukdar real wagt PCR).

Hakyky wagt RT-PCR (RT-qPCR), floresan mukdar tehnologiýasy bilen birleşdirilen ters transkripsiýa PCR: ilki RNK ters transkripsiýasyndan cDNA (RT) alyň, soňra mukdar derňewi üçin real wagt PCR ulanyň (qPCR).Laboratoriýalaryň köpüsinde RT-qPCR, ýagny RNK aňlatmasyny pes düzgünleşdirmek boýunça gözleg geçirilýär, şonuň üçin laboratoriýada her kimiň aýdýan qPCR aslynda RT-qPCR-e degişlidir, ýöne kliniki goşundylarda henizem DNK synaglarynyň bardygyny ýatdan çykarmaň.Gepatit B wirusy HBV-ni anyklamak ýaly mukdar derňewi.

Sorag: Floresan mukdar PCR-ni köp okanyňyzdan soň, güýçlendirilen bölegi 80-300bp aralygynda dolandyrmalymy?

Jogap: Her gen yzygiderliliginiň uzynlygy başga, käbiri birnäçe kb, käbiri ýüzlerçe at güýji, ýöne primer dizaýn edilende önümiň uzynlygynyň 80-300bp bolmagyny talap etmeli, gaty gysga ýa-da gaty uzyn, floresan mukdar PCR kesgitlemek üçin laýyk däl.Önümiň bölegi primer-dimerden tapawutlandyryp bolmajak derejede gysga.Primer-dimeriň uzynlygy takmynan 30-40bp, we 80bp-den pes bolsa, primer-dimer ýa-da önümdigini tapawutlandyrmak kyn.Önümiň bölegi gaty uzyn bolsa, 300bp-den geçse, pes güýçlendirme netijeliligine aňsatlyk bilen getirer we geniň mukdaryny netijeli kesgitläp bilmez.

Mysal üçin, synpda näçe adamyň bardygyny sanasaň, diňe näçe agzyň bardygyny sanamaly.Genleri kesgitläniňizde hem edil şonuň ýaly, diňe yzygiderliligi görkezmek üçin geniň belli bir yzygiderliligini kesgitlemeli.Adamlary sanamak isleseňiz, agzyňy, burnuňy, gulagyňy we äýnegiňi sanamaly, ýalňyşlyk goýbermek aňsat.

Giňeltmek üçin, biologiki gözleglerde nokatdan sebite köp gözleg işleri bolýar, sebäbi islendik görnüşiň gen yzygiderliligi gaty uzyn, bakteriýalaryň konserwatiw yzygiderliligini amala aşyrmak üçin bakteriýalaryň 16S yzygiderliligi ýaly ähli bölekleri ölçemek zerur däl we mümkin däl.

S: qPCR başlangyç dizaýny üçin iň amatly uzynlyk näçe?

Jogap: Umuman aýdanyňda, asmanyň uzynlygy 20-24bp töweregi, bu has gowudyr.Elbetde, primer düzülende primeriň TM bahasyna üns bermelidiris, sebäbi bu iň amatly anne temperaturasy bilen baglanyşykly.Köp synaglardan soň 60 ° C-iň has gowy TM bahasydygy subut edildi.Düwürtigiň temperaturasy gaty pes bolsa, aňsatlyk bilen güýçlendirilmezlige sebäp bolar.Düwürtme temperaturasy gaty ýokary bolsa, güýçlendirme netijeliligi birneme pes bolar, güýçlendirme egrisiniň iň ýokary derejesi soň başlar we KT bahasy gijikdiriler.

S: Boýag usuly gözleg usulyndan nähili tapawutlanýar?

Jogap: Boýag usulySYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO we ş.m. ýaly käbir floresan boýaglar öz-özünden ýagtylyk bermeýär, ýöne iki hatar DNK-nyň kiçi çukuryna baglanandan soň floresan çykar.Şonuň üçin PCR reaksiýasynyň başynda enjam floresan signalyny tapyp bilmeýär.Reaksiýa uzaldyş uzaldyş tapgyryna ýetende, goşa zolak açylýar we DNK polimerazynyň täsiri astynda täze sim sintez edilýär we floresan molekulasy dsDNA kiçi çukur bilen baglanyşýar.PCR siklleriniň sanynyň köpelmegi bilen has köp boýag iki hatar DNK bilen birleşýär we floresan signal hem yzygiderli güýçlenýär.Boýag usuly esasan ylmy gözleglerde ulanylýar.
PS: Synag geçirilende seresap boluň, boýag adam DNK bilen birleşdirilmelidir, ony floresan adama öwürmek üçin seresap boluň.

Boýag usuly (çepde) Gözleg usuly (sagda)
PS: Synag geçirilende seresap boluň, boýag adam DNK bilen birleşdirilmelidir, ony floresan adama öwürmek üçin seresap boluň.

SYBR Green DNK-nyň ownuk çukury bilen baglanyşýar

Gözleg usulyTakman zondy iň köp ulanylýan gidroliz zondy.Synagyň 5 ′ ujunda, adatça FAM-da floresan topary bar we zondyň özi maksatly gen bilen yzygiderlilikdir.3 ′ ujunda floresan söndüriji topar bar.Floresan rezonans energiýa geçiriş prinsipine (Förster rezonans energiýa geçirijisi, FRET), habarçy floresan topary (donor floresan molekulasy) we söndüriji floresan topary (kabul ediji floresan molekulasy) tolgunanda, spektr bir-birine gabat gelende we aralyk gaty ýakyn bolsa (7-10nm), donor molekulasynyň tolgunmagy kabul edijiniň flýuoressensiýasyna sebäp bolup biler.Şonuň üçin PCR reaksiýasynyň başynda, zond erkin we ulgamda üýtgemese, habarçy floresan topary floresan çykarmaz.Düwürdilende primer we zond şablona baglanýar.Giňeldiş döwründe polimeraza täze zynjyrlary yzygiderli sintez edýär.DNK polimeraza 5′-3 ′ ekzonukleýasiýa işjeňligi bar.Synaga ýeteniňde, DNK polimeraza zondy şablondan gidroliz eder, habarçy floresan toparyny söndüriji floresan toparyndan aýyrar we floresan signalyny çykarar.Synag bilen şablonyň arasynda ýeke-täk baglanyşyk barlygy sebäpli, synag usuly synagyň takyklygy we duýgurlygy taýdan boýag usulyndan has ýokarydyr.Synag usuly esasan diagnozda ulanylýar.

S: Mutlak bahalandyrma näme?Otnositel mukdar näme?

Jogap.Deňeşdirilen mukdarda alnan netije, belli bir nusgadaky maksatly geniň mukdarynyň başga bir nusga bilen deňeşdirilende üýtgemegi bolup, gen aňlatmasy kadalaşdyrylýar ýa-da pes düzgünleşdirilýär.

S: RNK çykarmagyň mukdary, ters transkripsiýa we güýçlendirme netijeliligi synag synaglarynyň netijelerine täsir edermi?
S: Saklamak, çykarmak reagentleri, ters transkripsiýa reagentleri we ýagtylyk geçiriji sarp ediş serişdeleri synag synaglarynyň netijelerine täsir edermi?
S: Synag maglumatlary haýsy usul düzedip biler?

Bu meseleler barada aşakda görkezilen we ösen bölümlerde jikme-jik beýan ederis.
2. Ösen bilimler

Hakyky floresan mukdar PCR barada aýdylanda, her ýyl müňlerçe ylmy gözleg işleriniň neşir edilýändigini, floresan mukdar PCR tehnologiýasynyň az däldigini hakykaty bilmelidiris.

Floresan mukdar PCR synagyny ölçemek üçin umumy standart ýok bolsa, netijeler dürli-dürli bolup biler.Şol bir görnüşdäki şol bir gen üçin, şol bir gaýtadan işlemek usuly bilen, ýüze çykaryş netijeleri hem dürli-dürli bolar we soňky gelenlere şol bir netijeleri gaýtalamak kyn bolar.Haýsynyň dogry, haýsynyň ýalňyşdygyny hiç kim bilenok.

Bu, floresan mukdar PCR-iň aldaw tehnologiýasydygyny ýa-da ygtybarsyz tehnologiýadygyny aňladýarmy?, Ok, sebäbi floresan mukdar PCR has duýgur we has takyk, biraz ýalňyş amal bolsa düýbünden ters netijeleri berer.Ujypsyzja ýitgi müň mil uzaklykda.Makalanyň awtory synçylar tarapyndan birnäçe gezek gynalyp bilner.Şol bir wagtyň özünde journalurnalyň synçylaryna dürli synag synaglaryndan saýlamak kyn.

Umuman aýdanyňda, real wagt PCR synaglarynda ylalaşygyň ýoklugyny görkezýär.Bu maksat bilen, pudakdaky uly alymlar standartlary düzüp başladylar,goşantçylardan bu ülňülere laýyk gelmek üçin makalada käbir zerur tejribe we maglumatlary gaýtadan işlemegiň jikme-jikliklerini (zerur maglumatlary goşmak bilen) talap edýär.

Synçylar bu jikme-jiklikleri okamak bilen synagyň hiline baha berip bilerler;geljekki okyjylar hem eksperimenti gaýtalamak ýa-da eksperimenti gowulandyrmak üçin ulanyp bilerler.Soňra bu usul bilen alnan synag synaglary maglumatlardan, ýokary hilli we ulanyp boljak zatlardan doly.

MIBBI (Biologiki we biomedikal gözlegler üçin iň az maglumat -http: // www.mibbi.org) ýüze çykdy.MIBBI synaglar üçin standartlary üpjün edýän taslama.Tebigatda çap edildi.Bu taslama öýjük biologiýasy, Microarray, häzir ara alyp maslahatlaşjak qPCR we ş.m. ýaly dürli biologiki synaglara gönükdirilendir we golýazmalar tabşyrylanda synaglaryň her görnüşini göz öňünde tutýar.Şol maglumatlar elmydama berilmelidir.

MIBBI taslamasynda floresan mukdar PCR bilen baglanyşykly iki makala bar, ýagny:
· RDML (Real-Time PCR Maglumatlary bellemek dili) - hakyky mukdarda PCR maglumatlary üçin düzülen dil we hasabat gollanmasy;
· MIQE (Mukdar mukdarda PCR synaglaryny neşir etmek üçin iň az maglumat) - hakyky mukdarda PCR synaglary barada makalalary çap etmek üçin iň az maglumat.
Ilki bilen terminologiýa spesifikasiýasy bolan RDML hakda gürleşeliň.

Hemme zat üçin standart kesgitleme ýok bolsa, çekişmäni dowam etdirmek mümkin däl, şonuň üçin synagda adalgalaryň düşündirilmegi gaty möhümdir.
Floresan mukdar PCR synagynda ulanylýan terminologiýa aşakdaky mazmuny öz içine alýar.QIAGEN biziň üçin iň gowy gysgaça mazmuny berdi.Aşakdakylaryň hemmesi guryharytlar .

Güýçlendirmek egrisi
Güýçlendirmek egrisi PCR prosesi wagtynda edilen egrini aňladýar, sikl belgisi abscissa we adaty reaksiýa wagtynda real wagt floresan intensiwligi.

Ajaýyp güýçlendirme egrisi aşakdaky aýratynlyklara eýe bolmalydyr: esasy tekiz ýa-da birneme azaldy, ýokary göteriliş ýok;egriniň inflýasiýa nokady düşnüklidir we ekspensial fazanyň eňegi güýçlendirme netijeliligine proporsionaldyr.Eňňit näçe uly bolsa, güýçlendirmek netijeliligi şonça ýokarydyr;umumy güýçlendirme egrisi Parallellik gowy, bu her turbanyň güýçlendirme netijeliliginiň meňzeşdigini görkezýär;pes konsentrasiýa nusgalarynyň güýçlendirme egrisiniň ekspensial fazasy görnüp dur.

Esasy (Esasy)
Esasy sikliň ses derejesi, adatça 3-15-nji sikl arasynda ölçelýär, sebäbi güýçlendiriji önümiň netijesinde ýüze çykan floresan bahasynyň ýokarlanmagy bu döwürde ýüze çykyp bilmeýär.Esasy hasaplamak üçin ulanylýan siklleriň sany dürli bolup biler we ýokary şablon mukdary ulanylsa ýa-da maksatly geniň aňlatma derejesi ýokary bolsa, azaldylmagy zerur bolup biler.

Esasy binýady düzmek, çyzykly güýçlendiriş egrisinden floresan maglumatlary görmegi talap edýär.Güýçlendirme egrisiniň ösüşi esasy sikliň ýokarky sanyndan has köp sikl sany bilen başlanar ýaly kesgitlenýär.Her maksat yzygiderliligi üçin esaslar aýratyn kesgitlenmeli.Irki sikllerde ýüze çykarylan ortaça floresan bahalary güýçlendirilen önümlerde alnan floresan bahalaryndan aýrylmalydyr.Dürli “Real-Time PCR” programma üpjünçiliginiň iň soňky wersiýalary aýratyn nusgalar üçin esasy sazlamalary awtomatiki optimizirlemäge mümkinçilik berýär.

PCR güýçlendirme reaksiýasynyň ilkinji birnäçe siklinde floresan signaly kän bir üýtgemeýär.Göni çyzga ýakynlaşmak esasy diýilýär, ýöne ilkinji sikllere ýakyndan göz aýlasak, aşaky suratda aşakdaky suratda bolup geçýän zatlary görýäris.

Düşündiriş
reaksiýada kesgitli floresan bahasy.Mysal üçin: netijesiz floresan söndürmek;ýa-da SYBR Green-yň ulanylmagy sebäpli iki hatar DNK şablonlary.Signalyň fon bölekleri, Real-Time PCR programma algoritmi bilen matematiki taýdan aýrylýar.

Habarçy signaly
Habarçy signaly SYBR Green tarapyndan döredilen floresan signaly ýa-da Real-Time PCR döwründe yzygiderli kesgitli zondlary bellik edýär.

Adatylaşdyrylan habarçy signaly (RN)
RN, her siklde ölçelýän passiw salgylanma boýagynyň floresan intensiwligi bilen bölünen habarçy boýagynyň floresan intensiwligini aňladýar.

Passiw salgylanma boýagy
Käbir real wagt PCR-lerde,floresan boýag ROX, floresan signaly kadalaşdyrmak üçin içerki salgylanma hökmünde ulanylýar.Gowy turbalar, guýynyň ýerleşişi we guýynyň esasynda floresan üýtgemeleri sebäpli üýtgemeleri düzedýär.

Floresan bosagasy (bosagasy)
fon bahasyndan ýokarlandyryldy we güýçlendiriji egriniň platon bahasyndan ep-esli pesdi.PCR kesgitlemesiniň logiki çyzykly diapazonyny görkezýän güýçlendirme egrisiniň çyzykly sebitinde bolmaly.PCR-iň logiki çyzykly fazasyny aňsatlyk bilen kesgitlemek üçin çäkler log-güýçlendiriji egrilik görnüşinde kesgitlenmeli.Real-Time PCR-de birnäçe maksatly gen bar bolsa, her maksat üçin çäk kesgitlenmeli.Umuman alanyňda, PCR reaksiýasynyň ilkinji 15 sikliniň floresan signaly floresan fon signaly hökmünde ulanylýar, we floresan çäkleri PCR-iň ilkinji 3-15 aýlawynyň floresan signalynyň adaty gyşarmasyndan 10 esse, floresan çäkleri bolsa PCR güýçlendirmegiň ekspensial tapgyrynda kesgitlenýär.Umuman aýdanyňda, her guralyň ulanmazdan ozal floresan çäkleri bar.

Sikl bosagasy (CT) ýa-da kesiş nokady (CP)
Güýçlendirmek egrisiniň bosagadan geçýän sikli (ýagny, floresan kesgitlemesiniň ep-esli ýokarlanýan nokady).KT bölek bolup biler we başlangyç şablonyň mukdary hasaplanyp bilner.KT bahasy, her PCR reaksiýa turbasyndaky floresan signalyň bellenilen çäklere ýeteninde başdan geçiren siklleriniň sanyny görkezýär.Her şablonyň CT bahasy bilen şablonyň başlangyç göçürme belgisiniň logarifminiň arasynda çyzykly baglanyşyk barbaşlangyç göçürme sany näçe ýokary bolsa, KT bahasy şonça-da kiçi we tersine.Adaty egri belgisi bolan standart ulanyp, adaty egrilik edilip bilner, onda abscissa CT bahasyny, ordinat bolsa başlangyç göçürme belgisiniň logarifmini görkezýär.Şonuň üçin näbelli nusganyň KT bahasy alynýança, nusganyň başlangyç göçürme belgisi adaty egrilikden hasaplanyp bilner.

ΔCT bahasy
ΔCT bahasy beýan edýärmaksatly gen bilen degişli endogen salgylanma geniniň CT bahasynyň arasyndaky tapawut, öý hyzmaty geni ýaly we ulanylýan şablonyň mukdaryny kadalaşdyrmak üçin ulanylýar:
⇒ΔCT = CT (maksatly gen) - KT (endogen salgylanma geni)

ΔΔCT bahasy
ΔΔCT bahasy, gyzyklanma nusgasynyň (Δ stimulirlenen öýjükler) ortaça ΔΔCT bahasy bilen salgylanma nusgasynyň ortaça ΔΔCT bahasynyň arasyndaky tapawudy suratlandyrýar (mysal üçin, gözegçilik edilmedik öýjükler).Salgylanma nusgasyna kalibrleme nusgasy hem diýilýär we beýleki nusgalar degişlilikde mukdarda kesgitlemek üçin kadalaşdyrylýar:
⇒ΔΔCT = ortaça ΔCT (göterim nusgasy) - ortaça ΔCT (salgylanma nusgasy)

Endogen salgylanma genleri (endogen salgylanma genleri)
Öý hyzmaty genleri (öý hyzmaty genleri) ýaly endogen salgylanma genleriniň aňlatma derejeleri nusgalaryň arasynda tapawut etmeýär.Salgy geniniň KT bahalaryny maksatly gen bilen deňeşdirmek, maksatly geniň aňlatma derejesini giriş RNK ýa-da cDNA mukdary bilen kadalaşdyrmaga mümkinçilik berýär (ýokardaky ΔCT bahalary bölümine serediň).

Içerki salgylanma genleri dogryRNK zaýalanmagy ýa-da RNK nusgalarynda ferment ingibitorlarynyň bolmagy, şeýle hem RNK mazmunynyň üýtgemegi, ters transkripsiýa netijeliligi, nuklein kislotasynyň dikeldilmegi we nusga işleýşi.Iň amatly salgy genini saýlamak üçin, tejribe şertlerine baglylykda iň amatly salgylanmany saýlamaga mümkinçilik bermek üçin algoritmi üýtgetdik.

Içerki gözegçilik
Maksat yzygiderliligi bilen birmeňzeş reaksiýada güýçlendirilen we başga bir zond bilen synag edilýän gözegçilik yzygiderliligi (ýagny, iki taraplaýyn PCR ýerine ýetirmek).Içerki dolandyryşlar, köplenç maksat yzygiderliligi kesgitlenmedik ýaly şowsuz güýçlendirmeleri aradan aýyrmak üçin ulanylýar.
Kalibrleme nusgasy
Geniň deňeşdiriliş derejesini kesgitlemek üçin beýleki ähli nusgalary deňeşdirmek üçin deňeşdirilen mukdarda ulanylýan salgylanma nusgasy (mysal üçin, öýjük çyzygyndan ýa-da dokumasyndan arassalanan RNK).Kalibrleme nusgasy islendik nusga bolup biler, ýöne adatça gözegçilik (mysal üçin, bejerilmedik nusga ýa-da synag wagtynyň nolundan bir nusga).

Oňyn dolandyryşlar
bilen gözegçilik reaksiýalaryny ulanyňbelli mukdarda şablon.Pozitiw dolandyryşlar köplenç primer toplumynyň ýa-da deslapky barlag toplumynyň dogry işleýändigini we reaksiýanyň dogry gurlandygyny barlamak üçin ulanylýar.

Şablon dolandyryşy ýok (NTC)
Adatça suw bilen çalşylýan şablondan başga güýçlendirme reaksiýasynyň ähli zerur komponentlerini öz içine alýan dolandyryş reaksiýasy.NTC-ni ulanmak, reagent hapalanmagy ýa-da daşary ýurt DNK-lary bilen ýüze çykýan hapalanmagy tapyp biler, şeýlelik bilen ýüze çykaryş maglumatlarynyň dogrulygyny we ygtybarlylygyny üpjün edip biler.NTC gözegçiliginiň güýçlendirilmegi hapalanmagy görkezýär.

RT gözegçilik ýok (NRT)
RNK çykarmak prosesi galyndy genom DNK-ny öz içine alyp biler, bu gaty zyýanly we maglumatlaryň hiline we qPCR-iň tebigy duşmanyna günäkärdir, şonuň üçin synaglar düzülende diňe RNK kesgitlemesini güýçlendirmek üçin işlenip düzülmelidir.Iki ýol bar, biri deslapky desgalaryň üstünden dizaýn etmek, beýlekisi DNK-ny düýbünden aýyrmak, haýsysynyň has gowusy, soňrak ara alnyp maslahatlaşylar.NTR gözegçiligi, DNK-nyň hapalanmagyny kesgitlemek üçin jadyly aýna.Güýçlendirmek bar bolsa, hapalanmagyň bardygyny aňladýar.

Standartlar
Standartlar, adaty egrini gurmak üçin ulanylýan belli konsentrasiýa ýa-da göçürme belgisiniň nusgalarydyr.Standartyň durnuklylygyny üpjün etmek üçin gen bölegi adatça plazmada klonlaşdyrylýar we standart hökmünde ulanylýar.

Adaty egrilik
köplenç iki esse gatnaşyga görä adaty önüm bilen azyndan 5 konsentrasiýa gradiýentine bölünýär we KT bahasynyň we göçürme belgisiniň koordinatlarynda 5 nokat çyzylýar we nokatlar adaty egrini döretmek üçin çyzyk emele getirýär.Her bir standart egrilik üçin onuň dogrulygyny barlamaly.Eňňidiň bahasy –3.3 bilen .83.8 arasynda bolýar we her konsentrasiýa üçlükde ýerine ýetirilýär.Beýleki nokatlardan düýpgöter tapawutlanýan nokatlar taşlanmalydyr.Synag ediljek nusganyň KT bahasy adaty egrä getirilýär we synagdan geçiriljek nusganyň aňlatma derejesi hasaplanyp bilner.

Synag ediljek nusganyň KT bahasy adaty egrä getirilýär we synagdan geçiriljek nusganyň başlangyç nusgasy hasaplanyp bilner.

Netijelilik we eňňit
Adaty egriniň eňegi real wagt PCR-iň netijeliligini görkezýär.
· -3.322 eňňit PCR güýçlendirmek netijeliliginiň 1 ýa-da 100% netijelidigini görkezýär we PCR önüminiň mukdary her siklde iki esse köpelýär.
· .33.322-den pes eňňit (meselem, –3.8) PCR netijeliligini görkezýär
· .33.322-den uly eňňit (meselem, –3.0) PCR netijeliliginiň 100% -den ýokarydygyny görkezýär, bu gyzykly, PCR-iň bir sikli güýçlendirilen önümi iki esse köp öndürip bilermi?Bu ýagdaý PCR reaksiýasynyň çyzykly däl fazasynda ýüze çykýar, ýagny köp mukdarda ýörite däl güýçlendirme bar.

ereýän egri
QPCR güýçlendirmek tamamlanandan soň PCR önümi gyzdyrylýar.Temperaturanyň ýokarlanmagy bilen iki hatar güýçlendiriji önüm kem-kemden ereýär we netijede floresan intensiwliginiň peselmegine sebäp bolýar.Belli bir temperatura (Tm) ýetilende köp mukdarda önüm erär.Floresan gaty peselýär.PCR-iň aýratynlygyny kesgitlemek üçin dürli PCR önümleriniň dürli Tm bahalary we dürli ereýän temperaturalary bar.

Ereýän egrilik (emele gelen egrilik)
Ereýän egri PCR önüm bölekleriniň ýagdaýyny has içgin görkezip bilýän iň ýokary kartany emele getirýär.Ereýän temperatura DNK böleginiň Tm bahasy bolany üçin, DNK böleginiň Tm bahasyna täsir edýän käbir parametrlere bölek ölçegi, GC mazmuny we ş.m. baha bermek mümkin. Umuman aýdanyňda, deslapky dizaýn ýörelgelerimize laýyklykda,güýçlendirilen önümiň uzynlygy 80-300bp aralygynda, şonuň üçin eremegiň temperaturasy 80 ° C bilen 90 ° C arasynda bolmaly.

Ereýän egriniň düşündirişi: Onlyeke-täk esasy pik 80 ° C-90 ° C aralygynda peýda bolsa, bu floresan mukdar PCR-iň kämildigini aňladýar;esasy pik 80 ° C-90 ° C aralygynda we dürli pikler 80 ° C-den aşakda peýda bolsa, başlangyç ölçeg esasan hasaplanýar.Ony çözmek üçin anne temperaturasyny ýokarlandyrmaga synanyşyp bilersiňiz;esasy pik 80 ° C-90 ° C aralygynda peýda bolsa we temperatura ýokarlananda dürli pik ýene-de peýda bolsa, esasan DNK hapalanmagy hasaplanýar we synagyň başlangyç döwründe DNK ýok edilmeli.

Elbetde, aşakda birin-birin döwüljek käbir adaty bolmadyk ýagdaýlar bar.
3. Ösen bilimler

QPCR etmek üçin MIQE diýmeli,Iň az maglumatneşir etmek üçinMukdarReal wagt PCRSynaglar - hakyky mukdarda PCR hakda makalalary çap etmek üçin iň az maglumatsynaglar.Her kimiň düşünjesini aňsatlaşdyrmak üçin esasy mazmuny ýönekeýleşdireris.

MIQE-iň asyl tekstini internetden gözläp bilersiňiz, iň esasy zat, bu şerti göz öňünde tutýarmakala çap edilende berilmeli maglumatlar barlag sanawy .

Synçylar bu jikme-jiklikleri okamak bilen synagyň hiline baha berip bilerler;geljekki okyjylar hem eksperimenti gaýtalamak ýa-da gowulandyrmak üçin ulanyp bilerler.
Bu sanawda her sanawyň ähmiýeti degişlilikde E ýa-da D bilen bellenendigini bellemelidiris.Bu näme many berýär?E: möhüm maglumatlar (tabşyrylmaly);D: islenýän maglumatlar (mümkin boldugyça beriň).

MIQE (1) - Synag dizaýny
Aspirantura okuwyny gutarandan soň goranyşyny gutaran köp sanly garakçy, özbaşdak eksperiment düzmegi, depderçelerini açmagy we mugallymyň buýruşyny bilmez.Netijede, eksperimental dizaýn gaty bir kyn bolmady we magazineurnalyň redaksiýa bölümi bu suraty we şol suraty düzmek isleýändiklerini aýtdylar, şonuň üçinem haýran galdylar.Gap-gaçlar şeýle ýasalýar!

Öýe has ýakyn, synagyň ilkinji ýörelgesi kesgitlemekdireksperimental logikanyň berkligi.Iň esasy zat eksperimental dizaýn, synag synagynyň iň möhümi, synag maglumatlaryna salgylanyp, deňeşdirip we ynandyryjy bolar ýaly maksat nusgasyny, salgylanma nusgasyny (gözegçilik) we gaýtalanmalaryň sanyny nädip kesgitlemeli.

Maksat nusgasybelli bir bejergiden soň maksatly geni kesgitlemegimizi talap edýän nusga degişlidir.Salgylanma nusgasyköplenç biologiýada ýabany görnüş diýlip atlandyrylýan bejergisiz nusga.

Synag köpeldýärörän möhümdir.Umuman, ynandyryjy köpeltmeleriň sany üçden köp bolmaly.Biologiki köpeltmegiň nämedigini we tehniki köpeltmegiň nämedigini tapawutlandyrmaly.

Biologiki köpeltmeler: Dürli materiallar (wagt, ösümlikler, partiýalar, reaksiýa plitalary) bilen geçirilen şol bir barlag synag.

Biologiki köpeltmek
Geliň, pestisid bejergisini mysal hökmünde alalyň.ABC-nyň üç ösümligine pestisidleri sepmek isleýäris, soň ABC-iň üç ösümligi üç sany biologiki köpeltme we dürli materiallar bilen geçirilen şol bir synag synag.Aöne synag hökmünde gözegçilik hökmany suratda zerurdyr, şonuň üçin A ösümliginiň synag toparyny döretmek üçin A ösümliginiň şahalarynyň birine pürküp bileris we gözegçilik topary döretmek üçin A ösümliginiň beýleki şahalaryny sepip bilmeris.B we C üçin hem şony ediň.

Tehniki göçürmeler (Tehniki göçürmeler): Amal sebäpli ýüze çykan ýalňyşlyklardan gaça durmak üçin döredilen gaýtalanýan synag, aslynda şol bir materialda goşulan iki gezek deşik.Bejergileriň we gözegçilikleriň ikisinde hem maksatly geniň we içerki salgylanma geniniň sazlamalary (azyndan üç) bolmaly.

Tehniki gaýtalama
Pestisidler bilen bejerilen burçuny ýene bir mysal hökmünde alyň.A ösümliginiň synag topary üçin, kesgitlenen gen we içerki salgylanma geni üçin degişlilikde 1, 2 we 3 sany üç sany PCR deşik ýasadyk, ýüze çykarylandan soň ortaça alarys.Ösümlige gözegçilik etmek üçin “A” toparlara-da edil şonuň ýaly garalýar.Edil şonuň ýaly, B we C ösümlikleri üçin edil şonuň ýaly bejergini ediň.Bu tehniki gaýtalanma.

Muny bellemelidirisstatistika girýän zat biologiki gaýtalanma we tehniki gaýtalanma, synag synaglarynda haýsydyr bir tötänleýin hadysanyň bardygyny ýa-da ýokdugyny barlamak, synag netijelerini ygtybarly etmek, ýagny ýygy-ýygydan aýdyşymyz ýaly ortaça hasaplamak bilen ýalňyşlyklardan gaça durmakdyr.

Ativearamaz gözegçilikler - NTC we NRT
NTC (Şablon gözegçiligi), şablonsyz dolandyryş, synag materialynyň hapalanandygyny ýa-da ýokdugyny barlamak üçin ulanylýar.Adatça suw şablon hökmünde ulanylýar.Floresan reaksiýa bar bolsa, nuklein kislotasynyň hapalanmagynyň barlaghanada ýüze çykandygyny görkezýär.

Bu hapalanmalar aşakdakylardan gelip çykýar: hapa suw, endogen DNK-ny öz içine alýan kwalifikasiýa reagentleri, başlangyç hapalanma, laboratoriýa enjamlarynyň hapalanmagy, aerozolyň hapalanmagy we ş.m., RNase ýuwujylary we RNase ingibitorlaryny ulanmalydyr.Aerozolyň hapalanmagyny tapmak iň kyn.Laboratoriýaňyz howada dürli nuklein kislotalary saklanan duman ýalydygyny göz öňüne getiriň.

NRT (Tersine transkripsiýa), ters transkripsiýasyz dolandyryş, ters däl transkripsiýaly RNK, negatiw gözegçilik hökmünde, gDNA galyndysyna gözegçilik.

Gen aňlatmasy ýerine ýetirilende, RNK mukdary ters transkripsiýadan soň cDNA mukdaryny kesgitlemek arkaly kesgitlenýär.RNK arassalananda gDNA galyndysy bar bolsa, synag synaglarynda ýalňyşlyklara sebäp bolar, sebäbi alnan hakyky netijeler gDNA we cDNA.Jemi derejede, diňe CDNA däl, RNK çykarmak wagtynda gDNA-ny doly aýyrmaly.

MIQE (2) - mysal maglumatlary
Mysal maglumatlary diýilýän zat, qPCR hakda makala çap edenimizde, makalanyň aýrylmaz bölegi bolan nusga maglumatlaryny anyk düşündirmelidigimizi aňladýar.Şonuň ýaly-da, nusgalary gaýtadan işleýänimizde, nusgalaryň dogrulygyny üpjün etmek üçin öz amallarymyzy hem düzgünleşdirmeli.

Nusganyň beýany diňe bir netijedir we tutuş synag wagtynda alnan materiallara has köp üns bermelidiris.

Synag materiallaryny saýlamak
Ganyň nusgalary - 4 sagatdan köp bolmadyk täze gany saýlaň.Öýjük nusgalary - güýçli ösýän döwürde täze öýjükleri ýygnamagy saýlaň.Haýwan dokumasy - Täze, güýçli ösýän dokumany saýlaň.Ösümlik dokumasy - Täze, ýaş dokumany saýlaň.

Bu birnäçe sözlemde esasy sözüň bardygyna göz ýetiren bolmaly: täze.
Aboveokardaky nusgalar üçin bazardaky iň oňat, tygşytly we durnukly toplum, DNK we RNK-ny çalt we aňsatlyk bilen çykaryp bilýän Foregene toplumydyr.

Gan DNK kiçi toplumy

Öýjükleriň jemi RNA izolýasiýa toplumy

Haýwanlaryň jemi RNK izolýasiýa toplumy

Ösümlikleriň jemi RNA izolýasiýa toplumy

Ösümlikleriň jemi RNA izolýasiýa toplumy

Ösümlik DNK izolýasiýa toplumy

Synag materiallaryny saklamak
Umuman aýdanyňda, şertler bar bolsa, nusgalary saklamagy maslahat bermeýäris.Şeýle-de bolsa, nusga alandan soň derrew synag geçirip bilmeýän dostlar köp, hatda käbirleri nusga almak üçin meýdana suwuk azot baklaryny alyp gitmeli.

Bu hili zähmetsöýer dostum üçin diňe reagent sarp edilýän zatlara düşünmeýärsiňiz diýip bilerin.Indi köp reagent sarp edilýän kompaniýalar RNK nusgalaryny otag temperaturasynda saklap bilýän reagentleri öndürýärler we ulanyp bilersiňiz.Adaty saklaýyş usuly, götermek aňsat bolan kiçijik suwuk azot tankyny ulanyp, suwuk azot saklamakdyr.Nusgany laboratoriýa getireniňizden soň, ony -80 ° C sowadyjyda saklaň.

RNK bilen baglanyşykly synaglar üçin alty sözli ýörelge berjaý edilmelidir:pes temperatura, ferment ýok,weçalt .

Pes temperatura düşünjesine düşünmek aňsat;fermentler bolmazdan, RNase biziň ýaşaýan dünýämiziň hemme ýerinde (ýogsam AIW tarapyndan öldürilen bolardyňyz), şonuň üçin synag geçirilende RNase-den nädip saklanmalydygy gaty möhüm düşünje;çalt,Dünýäde döwüp bolmaýan Kung Fu ýok, diňe tizligi bozup bolmaýar.

Şonuň üçin belli bir derejede gazyp almak wagty näçe gysga bolsa, şonça-da gowy bolar.Näme üçin?Foregenetoplumy tizligi nygtaýar, sebäbi olar muny gowy bilýärler.

PS: Käbir gyzlar synaglary gaty seresaplylyk bilen ýerine ýetirýärler, ýöne birnäçe ýyllap işlänlerinden soň gaty gowy däl.Hudaýyň adalatsyzdygyny, beýlekilerden zeýrenip, durmuş gözleýändigini duýýarlar.Aslynda, muňa düşünmedi.RNK-ny gowy goramady, samsyk oýunçy pälwan.Synag geçirýärkä, üç gezek, bäş gezek we iki bölüm bilen gutarar öýdüpdi, ýöne eksperimenti gowy geçirdi.

Bellik: RNase çozuşynyň has haýal, has köp mümkinçiligi.Özüňizi çalt bolmak üçin nädip türgenleşdirmeli?Wayol ýok, has köp amal ediň.

Dürli synaglar we dürli nusgalar üçin has köp edebiýaty okamak we gaýtadan işlemek üçin amatly usuly saýlamak zerur.Nusga ýygnamak we saklamak prosesi üçin, MIQE synçylar kagyzyň ygtybarlylygyny gözden geçirip biler ýaly, kagyzda anyk ýazylmagyny talap edýär we haýran galan ýaşlar üçin synagyňyzy gaýtalamak hem amatly.

Biologiki synaglar kyn bolsa-da, ýokary derejeli.Seresap bolmasaňyz, dünýäni agdaryp bilersiňiz.Mysal üçin, SARS-y biohimiki krizise öwürmek ýa-da 1,3 milliard adamy halas etmek üçin gibrid tüwi öndürmek.Aşakdaky surat himiki synag, gözlegleriňize diňe buýsanç görnüşine seredip, buýsanýandygyňyza düşünmeli.Forgetatdan çykar, ony gara etme.

MIQE (3) - nuklein kislotasyny çykarmak.
Nuklein kislotasyny çykarmak uly waka we ähli molekulýar biologiýa synaglary nuklein kislotasyny çykarmakdan başlaýar.Ilki bilen, nuklein kislotasyny çykarmakda MIQE-iň mazmunyny göçüreliň.

Bu görnüşe seretseň, üstünde durup bilmersiň.Forma dogma.Iň ýokary okuwçy bolmak üçin munuň sebäbini soramaly.Bu tablisanyň esasy mazmuny: KowmakRNK-nyň arassalygy, bitewiligi, yzygiderliligi we çykarylyşy .

Birinji bölümamal ýa-da gural nuklein kislotasyny çykarmak ädimidir.Eger çykarmak üçin awtomatiki nuklein kislotasy ekstraktoryny ulanýan bolsaňyz (ösen, satyn almak üçin maňa ýüz tutuň), guralyň model adyny görkezmeli.

Kitabyň ady we

Üýtgetme jikme-jiklikleri üçin haýsy toplum ulanyldy, haýsy ýörite reagentler goşuldy ýa-da başgalar siziň synagyňyzy aňsatlyk bilen gaýtalap biler ýaly anyk amallar edilmelidir.

Käbir adamlar munuň gizlin ýaragydyr öýdüp, başgalaryna aýtmaýarlar öýdüp, ýörite nusgalar çykarylanda käbir ýörite reagentleri goşýarlar.Gizlin saklamak bilen, makalaňyzy parlak etmek mümkinçiligini hem ýitirýärler.Akylly bolma, ylmy gözleglerde ýurduň garry Zhangangyndan has dogruçyl bolmaly, akylly bolmak isleseň, makala seni samsyk eder.

toplumyň önüm belgisini ýatda saklamalydyrkitaby zakaz edip, makalany ýazanyňyzda.Kitapda köplenç iki san bar: Pişik - katalog belgisi (önümiň belgisi, makala belgisi), Lot - önümiň nomeri (önümiň haýsy partiýadan gelendigini görkezmek üçin ulanylýar).

Mundan başga-da, biohimiki reagentleri sargyt edende CAS belgisi köplenç ulanylýar we men ony bilelikde ýaýradaryn.CAS belgisi, Amerikan himiýa jemgyýeti tarapyndan her täze himiki derman üçin berlen san.Umuman, üç san çyzyk bilen baglanyşýar.Ruşuiniň CAS belgisi: 7732-18-5.Himiki serişdelerde köplenç birnäçe lakam bar, ýöne CAS belgisi özboluşly.Derman sargyt edende, ilki bilen onuň CAS belgisini barlap bilersiňiz.

Öýe has ýakyn, näme üçin bu zatlary aýdyň suratlandyrmaly?Aslynda, RNK çykarmagyň hilini hem barlamak.Gurallaryň we toplumlaryň ulanylmagy RNK çykarmagy has yzygiderli eder.Ordinaryönekeý barlaghanalaryň gazyp almak masştaby uly däl we ony toplumlar bilen alyp bolýar.

DNase ýa-da RNase bejergisiniň jikme-jiklikleri
Floresan mukdar PCR-iň möhüm meselesi, DNK hapalanmagynyň öňüni almakdyr we hapalanma bar bolsa synag geçirmäň.Şol sebäpden, synag synagynda DNK-nyň doly we doly aýrylandygyny görkezmek üçin DNK-ny gaýtadan işlemek üçin ulanan amalyňyzy aýtmak hökmandyr.shematiki diagramma bilen görkezilýär.

RNK we DNK-nyň shemasy
Umuman alanyňda, DNK-ny aýyrmagyň usuly, RNK çykarylandan soň DNase bilen bejermekdir.Şeýle-de bolsa, bular köne usullar.Söwda RNK çykarmak toplumlary, DNase goşmazdan çykarmak prosesinde DNK-ny aýyrmagy başardy.Mysal üçin, “Foregene” -den birnäçe toplum.

Bellik: RNK çykarmak wagtynda DNK-ny aýyrmak, RNK çykarmagyň işleýiş wagtyny uzaldyp, RNK zaýalanmak howpuny ýokarlandyrjak gaty howply goşa gylyçdyr.Esasan, bu RNK hasyllylygy bilen arassalygynyň arasyndaky söwda.

Mundan başga-da, kremniniň esasly adsorbsion sütünine goşulan DNase mukdary gaty az we effekt gazanmak üçin ýokary hilli DNase ulanylmaly.Göz öňünde tutulmadyk DNase çalt we doly siňdirilip bilinmez.Bu täjiriň tehniki derejesiniň synagy.Elbetde, DNase-den aýrylyp bilinjekdigi bilen öwünýän has täsin söwdagärlerem bar.DNase bolmasa DNK-ny doly aýryp bolar diýip öwünýänleriň huligan bolandygyny aýdyp bolar.DNK birneme durnukly iki hatar gurluş bolup, ony diňe gürlemek we gülmek bilen ýok edip bolmaz.

Hapalanma baha bermek
baha beriş usuly: elektroforezi ýüze çykarmak, 1% agaroza, 6V / sm, 15min, ýüklemek 1-3 ul

Nuklein kislotasynyň mukdar derňewi
adatça UV spektrofotometr bilen ölçelýär.Ilki bilen OD260, OD280 we OD230 üç bahanyň manysyny köpçülige aýdaýyn.
· OD260nm: Nuklein kislotasynyň iň ýokary siňdiriş derejesiniň siňdiriş tolkun uzynlygy we iň gowy ölçenen bahasy 0,1 bilen 1,0 aralygyndadyr.Notok bolsa, nusgany aralyga getirmek üçin suwuklaň ýa-da jemläň.
· OD280nm: Belok we fenolik maddalaryň iň ýokary siňdiriş derejesiniň siňdiriş tolkun uzynlygydyr.
· OD230nm: Uglewodlaryň iň ýokary siňdiriş derejesiniň siňdiriş tolkun uzynlygy.

Indiki, her görkezijiniň roly barada gürleşeliň.A260 üçin nuklein kislotasynyň hasyllylygyny ölçemek üçin ulanylyp bilner.OD260 = 1 bolanda, dsDNA = 50μg / ml, ssDNA = 37μg / ml, RNA = 40μg / ml.

Arassalyk üçin, köplenç görýän gatnaşygymyza seretmeli: OD260 / 280 we OD260 / 230.
· Arassa DNK: OD260 / 280 takmynan 1,8 deňdir.1,9-dan uly bolanda, RNK-nyň hapalanmagynyň bardygyny, 1,6-dan az bolanda bolsa, beloklaryň we fenollaryň hapalanmagynyň bardygyny görkezýär.
· Arassa RNK: 1.7
· OD260 / 230: DNK ýa-da RNK bolsun, salgylanma bahasy 2,5.2.0-den az bolanda, şekeriň, duzuň we organiki maddalaryň hapalanýandygyny görkezýär.

RNK bitewiligi

RNK-nyň bitewiligini ölçemek gaty möhümdir.Adatça, 28S bilen 18S RNK-nyň arasyndaky ýagtylygyň iki esse gatnaşykdygyny ýa-da ýokdugyny barlamak üçin RNK denaturasiýa jel synagyny geçirmeli.Üçünji topar 5S peýda bolanda, oňurgasyz haýwanlardan başga RNK-nyň peselip başlandygyny aňladýar.

RNK hilini bahalandyrmak üçin maglumatlar: aboveokardaky synaglardan başga-da, RNK-nyň görünmeýän derejede peselendigini ýa-da ýokdugyny anyklap bilýän Experion awtomatiki elektroforez ulgamynyň RQI bitewiligi synagy ýaly RNK bitewiligi taýdan has ösen gural synaglary hem bar.

Ylmy gözleglerde, floresan mukdar PCR maksatly gen bilen içerki salgylanma geniniň arasyndaky deňeşdirme.Şonuň üçin RNK nusgasyny gorap saklamak, RNK çykarmak we ş.m. esasy maksat RNK-nyň bitewiligini üpjün etmekdir.

RNK-nyň bitewiligi maksatly gen bilen içerki salgylanma geniniň arasyndaky deňagramlylyga nähili täsir edýär, aşakdaky suratdan aňsatlyk bilen düşünip bolýar.Pese gaçmagy geniň doly dälligine getirer, içerki salgylanma geniniň doly bolmazlygy ýa-da maksatly geniň doly bolmazlygy, maglumatlara uly täsir eder.

Maksatly geniň we salgylanma geniniň shemasy dogry bolmaly däldir

Gadaganlyk synagy (KT bahasy ýokary ýa-da pes konsentrasiýa ýa-da başga şertlerde basylýarmy)

Bu şekili mysal hökmünde alyp, bäş egriniň Ct bahalary aşakdaky ýaly.KT bahalarynyň egrileriň arasynda paýlanyşy deň däl we Ct bahalary ýokary we pes konsentrasiýalarda gijikdirilýär, bu PCR inhibisiýasydyr.

Esasy nokat: RNK çykarmak prosesinde ýalňyş düşünjelerden ýüz öwürmeli we dogry düşünjeleri döretmeli.

Nädogry pikir: RNK çykarmak, alnan RNK mukdary näçe köp bolsa, şonça-da gowudyr öýdüp, hasyllylygy yzarlaýar.Aslynda, mukdar kesgitlänimizde, genleriň sany gaty köp bolmasa, bize RNK gerek däl.Çykarylýan RNK mukdary ýeterlikdir.

Dogry düşünje:RNK çykarmak arassalygy, bitewiligi we yzygiderliligi yzarlamalydyr.Arassalyk, indiki ters transkripsiýanyň päsgel bermezligini we maglumatlaryň DNK täsir etmezligini üpjün edip biler.Bütewilik maksat yzygiderliliginiň we içerki salgylanmalaryň deňagramlylygyny üpjün edýär.Yzygiderlilik, nusga nusgasynyň ýüklenmegini üpjün edýär.

MIQE (4) - ters transkripsiýa
Nädogry düşünje: has ýokary nusga göwrümini gözlemek.
Dogry düşünje: Rüklenen RNK mukdaryna garamazdan yzygiderliligi (durnuklylygy) yzarlaň, ters transkripsiýanyň netijeliligi yzygiderli bolup, cDNA tapawudynyň mRNA tapawudyny hakykatdanam görkezip biljekdigini üpjün edýär.
Bu prosesi shematiki diagramma bilen düşündirýäris:

Tersine transkripsiýanyň netijeliliginiň shemasy dogry däl
Ilki bilen ters transkripsiýa prosesi bilen PCR prosesiniň arasyndaky tapawuda düşünmelidiris.PCR birnäçe ýyladyş we gyzdyryjy amallary başdan geçirýär we maksat bölegi çalt ösýär;ters transkripsiýanyň bu prosesi ýok bolsa-da, tersine transkripsiýanyň aslynda ýeke-täk bolandygyny göz öňüne getirip bileris, köpeltmek prosesinde RNK-nyň köp bölegi

CDNA maglumatlarynyň köp bölegini alyp bolýandygy sebäpli, häzirlikçe düşünmeli, sebäbi uly we kiçi bölekler tersine ýazylypdy we bir bölege ünsi jemlemek mümkin däl.RNK-nyň mukdary birneme az bolany üçin, güýçlendirilen täsiri bolan PCR-den tapawutlylykda alnan CDNA mukdary hem az bolýar, şonuň üçin ony tapmak mümkin däl.

cDNA elektroforeziň netijeleri
Ikinjiden, iň gowusy, ters transkripsiýa ýeke-ýekeden ýerine ýetirilýär, ýöne haýsydyr bir kompaniýanyň tersine transkriptazasy bu täsire ýetip bilmez.Esasan, ters transkriptazlaryň köpüsiniň netijeliligi 30-50% arasynda aýlanýar.Şeýle bolsa, şekilde görmek isleýän zadymyz üçin has durnukly ters transkripsiýa netijeliligine eýe bolarys: 3 RNK 2 CDNA, 6 RNK 4 CDNA alýar, şonuň üçin näçe nusga ýüklense-de, ters transkripsiýa netijeliligi birneme durnukly.Tersine transkripsiýa netijeliliginiň durnuksyz we ýokary konsentrasiýasynyň saklanýan ýagdaýyny görmek islemeýäris.

Şeýlelik bilen, ters transkripsiýanyň netijeliligini nädip barlamaly?Usul gaty ýönekeý, diňe deňeşdirme synagyny geçirmeli: biri RNK-ny iki gezek eritenden soň CDNA-da tersine transkripsiýa, beýlekisi bolsa CDNA-a tersine transkripsiýadan soň iki esse eritmek, soň bolsa alnan eňňidini görmek üçin qPCR etmek.Iň ýokary okuwçy hökmünde sekuntlara düşünmeli.Aşakda görkezilişi ýaly:

Tersine transkripsiýanyň netijeliligini barlamak üçin RNK we cDNA-ny eritmek
Tersine transkriptaza we toplum
Floresan mukdar PCR-iň ajaýyp ters transkriptazasy we toplumy nädip bolup biler.Ters transkriptaz, çeşmä görä AMV ýa-da takmynan iki görnüşe bölünýärM-MLVwe olaryň ýerine ýetirişleri tablisada görkezilişi ýalydyr.

RNase H işjeňligi
RNase H Ribonukleýz H, hytaý ady ribonukleýz H bolup, DNK-RNA gibrid zynjyrynda RNK-ny ýörite gidrolizläp bilýän endoribonukleýzdir.RNase H fosfodester baglanyşyklaryny bir hatar ýa-da iki hatar DNK ýa-da RNK-da gidroliz edip bilmeýär, ýagny bir hatar ýa-da iki hatar DNK ýa-da RNK siňdirip bilmeýär.CDNA-nyň ikinji setiriniň sintezinde köplenç ulanylýar.

Bu geň zat.Tersine transkriptazyň RNase H işjeňligi bar diýýäris, tersine transkriptazda RNase H-ni öz içine almaýar we RNase H-ni ters transkriptazadan aýyrmak mümkin däl, belki-de ters transkriptazada käbir toparlaryň üýtgemegi sebäpli bu iş ters transkriptaza sebäp bolýar.

Şonuň üçin AMV-iň ýokary ters transkripsiýa netijeliligine garamazdan, onuň RNase H işjeňligi cDNA-nyň hasyllylygyny peseldýär.Elbetde, reagent öndürijiler, CDNA-nyň hasyllylygyny ýokarlandyrmak üçin mümkin boldugyça ters transkriptazda RNase H işjeňligini ýok etmek üçin önümlerini yzygiderli optimizirleýärler.
Annealing temperaturasy

Dürli temperaturada RNK-nyň ikinji derejeli gurluşy
Dürli temperaturada RNK-nyň ikinji derejeli gurluşy üçin ýokardaky surata serediň we belli bir temperatura we duz konsentrasiýasy şertlerinde maksat bölekiniň ikinji derejeli gurluşyny kesgitlemek üçin mFold onlaýn guralyny ulanyň.55 ° C-de, RNK-nyň ikinji derejeli gurluşy henizem gaty çylşyrymly, ters transkriptaz işläp bilmeýär we ikinji derejeli gurluş 65 ° C-e çenli doly çözülip bilinmeýär, şol bir wagtyň özünde AMV we M-MLV-iň optimal temperaturasy bu temperaturadan has pesdir.
näme etmeli?Ikinji gurluş, şablonyň goşmaça jübütleşmegi bolup, primer we ters transkriptaz bilen şablonyň arasynda güýçli bäsdeşlige sebäp bolýar, netijede pes E we pes gaýtalanma ýaly birnäçe problema ýüze çykýar.

näme etmeli?Diňe gyzdyryjy temperaturany mümkin boldugyça ýokarlandyryň.

Reagent öndürijileriň köpüsi genetiki in engineeringenerçilik arkaly ters transkriptazasyny gowulandyrýarlar.Käbirleri Jifan we Aidelai ýaly reaksiýa temperaturasyny ýokarlandyrýarlar, käbirleri ferment bilen RNK şablonynyň arasyndaky ýakynlygy gowulandyrmak üçin RNase H fermentiniň işjeň toparyny aýyrýarlar.Inityokary ýakynlyk, ikinji derejeli gurluşy bäsdeşlik edip gysyp, rahat okap biler, şeýle hem ters transkripsiýanyň netijeliligini ep-esli ýokarlandyryp biler.
Esasy nokat: Tersine transkripsiýa, ýüklenen nusganyň mukdaryna däl-de, tersine transkripsiýa netijeliliginiň yzygiderliligini yzarlamak has möhümdir (fermentler diňe bir uly göwrümli floresan mukdar PCR däl bolsa, asla mümkin bolmaz).Birnäçe CDNA.
Dürli öndürijiler hem yzygiderlilik ugrunda käbir tagallalary etdiler.Mysal üçin, kompaniýalaryň köpüsi indi satuw üçin adaty toplum hökmünde ters transkripsiýany gapladylar, bu gowy saýlaw.
Mysal üçin, “Foregene” -niň “RT Easy Series” toplumlary:

RT Easy I (birinji setirli CDNA sintez toplumy üçin ussat premiks)

MIQE (5) - maksatly gen maglumatlary

Aboveokardaky surat düşündirýär
1. Bu geniň gaýtalanýan synaglar üçin täsirli ýa-da ýokdugyny, köplenç gaýtalanýan synaglar arkaly barlap bolýar.
2. Gen ID, bilýärsiňiz.
3. Gen uzynlygy, maksatly geniň umumy uzynlygy hökman problema däl.Astarlar düzülende amplikonyň uzynlygynyň has gowy güýçlendirmek netijeliligini üpjün etmek üçin 80-200bp aralygyndadygyna göz ýetiriň.
4. Yzygiderli partlama deňeşdirme maglumatlary, belli bir güýçlendirilmeginiň öňüni almak üçin maksatly gen genbankda deňeşdirilmeli.
5. Pseudogenleriň bolmagy.Pseudogen adaty gen ýaly DNK yzygiderliligi, ýöne adaty işini ýitirýär.Köplenç eukariotlaryň köp genli maşgalasynda bar.Adatça by bilen aňladylýar.Bu genomda işlemeýän genom DNK nusgasy, kodlaşdyrmagyň gen yzygiderliligine gaty meňzeýär., köplenç transkripsiýa edilmeýär we anyk fiziologiki manysy ýok.
6. Primerleriň eksonlara we içeriklere görä ýerleşişi.Ilkinji ýyllarda DNK bilen hapalanmak meselesini çözenimizde, köplenç primerleriň, eksonlaryň we içegeleriň ýagdaýyna üns berdik we DNK güýçlendirilmezligi üçin köplenç içerde desgalary dizaýn etmegi göz öňünde tutýardyk.Aşakdaky surata serediň: gara reňkleri, dürli gök reňkler eksonlary, gülgüne umumy primerleri, açyk gyzyl reňkli içki elementleri aňladýar.

Shematik, hiç haçan dogry däl
Bu nähili ajaýyp meýilnama ýaly görünýär, ýöne aslynda köplenç trans-intron primerleri göz öňüne getirilişi ýaly jadyly däl we belli bir güýçlenmä sebäp bolar.Şonuň üçin DNK hapalanmagynyň öňüni almagyň iň gowy usuly DNK-ny doly aýyrmakdyr.
7. Üýtgedip gurmak çaklamasy.Bu mysaly gaýtadan ulanyp, belli bir temperaturada we duz konsentrasiýasynda maksat bölekiniň ikinji derejeli gurluşyny kesgitlemek üçin mFold onlaýn guralyny ulanyň.

Dürli temperaturada RNK-nyň ikinji derejeli gurluşy
Ikinji gurluş, şablonyň goşmaça jübütleşmegi bolup, primer bilen şablon jübütleşmeginiň arasynda güýçli bäsdeşlige sebäp bolar we asma baglanyşyk ähtimallygy az bolýar, netijede pes E we pes gaýtalanma ýaly bir topar problema ýüze çykýar.Programma üpjünçiligini çaklamak arkaly, ikinji derejeli gurluş meselesi bolmasa, gaty gowy bolardy.Eger bar bolsa, indiki makalamyzda bu meseläni nädip çözmelidigini ara alyp maslahatlaşarys.

MIQE (6) —qPCR Oligonukleotidler

Floresan mukdar PCR üçin, her gün ilkinji göreşýän zadyňyz RNK çykarmak, ikinjisi başlangyç dizaýn bolup biler.
Ilki bilen, MIQE gözegçilik sanawyna laýyklykda deslapky dizaýn düzgünlerini barlaýarys.Gap-gaçlar gülüp bilýänligi gaty ýönekeý we biz ony bir sözlemde tamamlap bileris: deslapky gözlegiň yzygiderliligini we ýagdaýyny we üýtgetmek usulyny biliň.Astar arassalamak usuly üçin, häzirki wagtda sintez gaty arzan, qPCR PAGE we ýokarda arassalama usullaryna mynasyp, sintez guralynyň maglumatlary möhüm däl.Köp adamlar onlarça ýyl bäri primer edýärler we sintezatoryň ABI3900dygyny bilenoklar.
Astar dizaýnynyň prinsipleri barada aýdylanda, olary ýatdan ýatda saklamaly dälsiňiz, sebäbi deslapky dizaýn programma üpjünçiliginiň ýa-da onlaýn gurallaryň köpüsi bu problemalary çözüp biler (maslahat berilýän onlaýn gural primer3.ut.ee/) we başlangyç dizaýnyň 99,999% el bilen ýerine ýetirilmeýär Seret, awtor käwagt günde ýüzlerçe primer dizaýn edýär, birin-birin okasaňyz, biri-birine göz aýlaýar.
Astarlar düzülenden soň aşakdaky nokatlary barlaň:
1. 3 ′ ujuna ýakyn dizaýn desgalary: ODigo primerlerini cDNA birinji hatar sintezi üçin ulanan ýagdaýynda, ters transkripsiýanyň netijeliligini we RNK bitewiligini göz öňünde tutup, güýçlendirilen netijeliligi ýokarlandyrmak üçin taslanan primerler 3 ′ ujuna ýakyn dizaýn edilmeli.Aşakdaky ýaly düşündirmek üçin surat ulanyň (muňa düşünmäge ýol ýok):

Primerler näme üçin 3 ′ ujuna ýakyn dizaýn edilmeli, bu dogry bolmaly däl
2. TM bahasy: Tm bahasy 55-65 ° C (sebäbi ekzonukleýiň işjeňligi iň ýokary 60 ° C), GC mazmuny bolsa 40% -60%.
3. BLAST: Genomyň aýratyn güýçlendirilmezligi üçin goşmaça barlag üçin Blast ulanylmaly.

MIQE (7) —qPCR prosesi

1. qPCR toplumy
MIQE-iň talaplaryna laýyklykda, PCR reaksiýa ulgamynyň konfigurasiýasyny, haýsy toplumyň ulanylýandygyny, öndürijiniň kimdigini, reaksiýa ulgamynyň näderejede uludygyny, boýag usuly ýa-da gözleg usuly ulanylýandygyny, PCR programma sazlamalaryny goşmak bilen, makaladaky doly reaksiýa şertlerini anyk suratlandyrmalydyrys.Weteran sürüjiler toplum saýlanylsa, ýokardaky maglumatlaryň esasan kesgitlenjekdigine hökman göz ýetirerler.
Häzirki wagtda floresan mukdarda PCR toplumlaryny öndürmek we öndürmek gaty ösen tehnologiýa.Örän erbet öndürijileri saýlamasaňyz, problemalaryň ähtimallygy ýokary däl, ýöne şonda-da birnäçe pikir bilen paýlaşmak isleýäris:
Gyzgyn başlangyç Taq fermenti:PCR-iň iň möhüm bölegi, gyzgyn başlangyç Taq fermentidir.Bazardaky gyzgyn başlangyç fermentler, adatça, iki görnüşe bölünýär, biri himiki taýdan üýtgedilen gyzgyn başlangyç fermentdir (muny parafin goýmagy diýip göz öňüne getirip bilersiňiz), beýlekisi antikorlary üýtgetmek üçin gyzgyn başlangyç fermentdir (antigen-antikor baglaýjy).Himiki üýtgetme, gyzgyn başlangyç fermentleriň irki usulydyr.Belli bir temperatura ýetende, ferment işjeňligini çykarar.Antikor üýtgedilen gyzgyn başlangyç ferment fermentiň işjeňligini bökdemek üçin biologiki usullary ulanýar.Belli bir temperatura ýetilende antikor denatirlener we belok hökmünde hereketsiz bolar we ferment işjeňligi güýje girer.

Muňa garamazdan, munuň peýdasy näme?Bu şeýle, antikor üýtgedilen fermentleriň goýberiliş işjeňligi himiki taýdan üýtgedilen fermentlerden has çalt, şonuň üçin duýgurlyk nukdaýnazaryndan antikor üýtgedilen fermentler birneme artykmaçlyga eýe, şonuň üçin bazardaky toplumlarda himiki taýdan üýtgedilen fermentler ýok.Eger bar bolsa, bu öndürijiniň tehnologiýasy henizem müňýyllyk döwründe galypdyr.
Magniý ionynyň konsentrasiýasy:PCR reaksiýasynda magniý ionynyň konsentrasiýasy örän möhümdir.Degişli magniý ion konsentrasiýasy Taq ferment işjeňliginiň çykmagyna kömek edip biler.Eger konsentrasiýa gaty pes bolsa, fermentleriň işjeňligi ep-esli azalar;konsentrasiýasy gaty ýokary bolsa, ferment katalizlenen aýratyn güýçlendirme güýçlendiriler.Magniý ionlarynyň konsentrasiýasy primerleriň garyşmagyna, şablonyň ereýän temperaturasyna we PCR önümlerine täsir edip, güýçlendirilen bölekleriň hasyllylygyna täsir eder.Magniý ionlarynyň konsentrasiýasy adatça 25mM-de gözegçilik edilýär.Elbetde, gowy toplum üçin magniý ionlarynyň konsentrasiýasy gowy gözegçilikde saklanmalydyr.Käbir söwdagärler magniý ionynyň konsentrasiýasyny awtomatiki sazlamagyň täsirine ýetip bilýän reagente magniý ionyny garyjy serişdäni goşýarlar.
Floresan boýag konsentrasiýasy:Adatça ulanýan SYBR Greenaşyl bolan floresan boýag, esasan, iki hatar DNK-nyň kiçi çukuryna baglamak arkaly floresan döredýär, sebäbi boýagyň iki hatar DNK bilen baglanyşygy aýratyn däl, ýagny iki hatar DNK bilen birleşdirilse, floresan döräp biler, şonuň üçin ulgamdaky başlangyç ölçegler we DNK şablonlary birleşer.
PS: lightagtylyga duýgur häsiýetleri sebäpli bazardaky önümler köplenç goňur açyk merkezden gaçyryş turbalarynda gaplanýar (aşakdaky suratda görkezilişi ýaly).Şeýle-de bolsa, bu bir mesele bilen ýüzbe-ýüz bolar.Synag geçirilende suwuklygyň sorulandygyny ýa-da ýokdugyny görmek kyn.Bu nukdaýnazardan, Çingke hakykatdanam ulanyjy üçin iň amatlydyr (aşakdaky suratda görkezilişi ýaly) we aç-açan turba aç-açan gapjykda gaplanýar.Soňra ýagtylykdan we nusgalardan gaça durmagyň amatlylygyny göz öňünde tutup, gap-gaç sumkasyna salyň.Dogry önüm belgisini saýlamaly.TSE204, ot ekmek isleýän, gaty tygşytly barlyk.

Floresan boýagyň konsentrasiýasy hem örän möhümdir.Eger konsentrasiýa gaty pes bolsa, güýçlendirme egrisi indiki tapgyra çykmaz we kämil bolmaz;konsentrasiýasy gaty ýokary bolsa, ses päsgelçiligine sebäp bolar.Floresan mukdar PCR esasan KT bahasyna bagly bolany üçin, floresan boýagyň konsentrasiýasy dogry sazlanmasa, pes nokat ýokary nokatdan has gowudyr.Elbetde, boýagyň degişli konsentrasiýasy iň gowusydyr.

ROX: ROX boýaglary gowy floresan signal ýalňyşlyklaryny düzetmek üçin ulanylýar.Käbir gural öndürijileri kalibrlemäni talap edýär, beýlekileri talap etmeýär.Mysal üçin, “Termo Fisher Scientific” -iň “Real Time PCR” güýçlendiriji guralynyň ulanylmagy, adatça 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus we ş.m. kalibrlemäni talap edýär.
Foregene-iň qPCR garyndysynda dürli modellerde ulanmak üçin amatly ROX boýagy hem bar.

Hakyky wagt PCR Kit-Takman

Gowşak wodorod baglanyşygy: Gowşak wodorod baglanyşyklaryny bejermek birneme tehniki mesele.Köp esbaplaryň gollanmalaryny hiç zat okamady, ýöne olaryň hiç biri-de bu mowzugy agzamady.Aslynda bu gaty möhümdir.Bazalaryň birleşmegi esasan wodorod baglanyşyklarynyň berkligine baglydyr.Güýçli wodorod baglanyşyklary adaty güýçlendirme bolup, gowşak wodorod baglanyşyklary belli bolmadyk güýçlendirilmegine getirýär.Gowşak wodorod baglanyşyklaryny gowy ýok edip bolmaýan bolsa, aýratyn güýçlendirmekden saklanyp bolmaz.Awtoryň çäginde bu meseläni diňe birnäçe kompaniýa gördi.Kitaby satyn alanyňyzda, saýlamak isleýän toplumyňyz üçin bu meselede çözgüt göz öňünde tutandygyňyzy ýa-da ýokdugyny görkezip bilersiňiz.

Reaksiýanyň göwrümi: 20-50ul ulgamy has köp ulanylýar we kiçi göwrümli ýalňyşlyklara sebäp bolup biler.Umuman aýdanyňda, toplum görkezmeleri PCR reaksiýa göwrümlerini ulanmagy maslahat berer.Akylly bolmaň we çykdajylary tygşytlamak üçin kiçi göwrümleri ulanyň.maksady.Söwdagärler tarapyndan maslahat berilýän ses hakykatda synagdan geçirildi we belki kiçi göwrümli ýalňyşlyklar meselesini çözüp bilmezler.
2. Turba plastinkasynyň öndürijisi we makala belgisi
Floresan mukdar PCR prinsipini hemmeler bilýär.Floresan ýygnamak, esasan PCR turba gapaklary arkaly amala aşyrylýar.PCR sarp ediş materiallaryny saýlanyňyzda, iki nokada üns beriň: ýagtylygyň gowy geçirilmegi we gural üçin amatly.Umuman aýdanyňda, esasy markalaryň tagtalary we turbalary gowy, ýöne uýgunlaşma nukdaýnazaryndan ünsli saýlamaly bolarsyňyz, ýogsam guraly ulanyp bilmersiňiz.

4. Iň ýokary derejeli bilim

MIQE (8) —qPCR tassyklamasy
Bu, qPCR-iň esasy meselesi!Şonuň üçin köp gahryman bu ýerde guma düşdi.Elbetde, bagtly bolmagyňyz we öwrenen genleriňiziň ýönekeý bolmagy hem mümkindir, şonuň üçin buz gowagyndan ýeliň üstünde ýüzüp bilersiňiz.QPCR-iň tassyklama maglumatlary, maglumatlaryň ygtybarlylygyny barlamak üçin niýetlenendir.Zerur tassyklama maglumatlaryny aşakdaky ýaly sanap geçýäris:

1. Aýratynlyk synagy
Maksatly gen güýçlendirmek aýratynlygy, elektroforez suratynyň bir zolakdygyny ýa-da ýokdugyny barlamak arkaly barlanýar;yzygiderliligi barlamak;pik kartanyň ýeke-täkdigini ýa-da ýokdugyny görmek üçin ereýän egri;ferment siňdirişini barlamak we beýleki usullar.
Bu ýerde, tegrileri eretmek usulyny ulanyp, ýörite däl güýçlendirme derňewi.Umuman aýdanyňda, desgalary düzenimizde, önümiň bölekleriniň ululygy 80-200bp aralygynda bolmaly, bu PCR önüminiň ereýän temperaturasyny 80-85 ° C aralygynda edýär.Şonuň üçin dürli pikler bar bolsa, başga güýçlendiriji önümler bolmaly;iň ýokary derejesi 80 ° C-den aşakda görünýän bolsa, adatça başlangyç ölçeg hasaplanýar;iň ýokary derejesi 85 ° C-den ýokary bolsa, adatça DNK hapalanmagy ýa-da uly bölekleriň belli bolmadyk güýçlendirilmegi hasaplanýar.
Bellik: Käwagt 80 ° C-de diňe bir pik bar.Häzirki wagtda bu düşünje berjaý edilmelidir.Güýçlendirmek netijeleriniň hemmesiniň başlangyç ölçegleri bolmagy ähtimal.

Adaty ereýän egrilik (aýratyn güýçlendirilmedik ýeke pik)

Mesele eremegiň egrisi (ýalňyş pikleriň aýratyn güýçlendirilmegi)
【Mysal derňewi】

Esasy pik bar, ýöne deslapky ölçeg çynlakaý
Aşakdaky şekilde bir gezeklik ereýän egri, ajaýyp synag diýip pikir edip, gözüňizi aňsatlyk bilen aldap biler, ýöne netije düýbünden ýalňyş.Bu wagt ereýän temperatura seretmeli.Iň ýokary temperatura 80 ° C-den pesdir, bu bolsa düýbünden pesdir.

Maksat bölegi ýok, ähli başlangyç ölçegler
Ine, agam durup bilmeýär.Aşakdaky surat, maňa kezzap tarapyndan iberilen jübi telefony bilen düşürilen surat.Onuň ulanan reagentleri, bu pudakda köplenç ulanylýan markalardyr.Bir T-prefiks markasyndan beýleki T-prefiks markasyna öwrüldi.Meniň pikirimçe, eýýäm çakladyňyz.Gap-gaç maňa aglady: “Birinji suratda ulanylan reagent gaty gowy we pik ýeke.Soň bolsa, maslahat beren reagenti ulananyňyzdan soň, garyşyk pikler bilen ikinji surat ýaly bolýar.Sen meni betbagt etdiň.“
Iki grafigi aýryň.Bir seretseň, biriniň ýeke pikiri, beýlekisinde goşa pik bar.Bolgusyz, ýekeje pik elbetde gowy.Bu hakykatmy?
Dou E-den erbet tarapy, iki suraty aşakdaky surata goýsam, derrew düşünersiňiz.Aslynda, bu görnüşdäki surat aňsatlyk bilen ysmaz.Seresaplylyk bilen seljerenimizden soň, ilkinji şekiliň iň ýokary derejesiniň 75 ° C-e ýetendigine göz ýetirdik;ikinji şekiliň iň ýokary derejesi 75 ° C we 82 ° C, iň bolmanda önüm peýda bolýar.

Talyplaryň pikirleriniň suratlary
Şonuň üçin esasy mesele reagentler meselesi däl-de, deslapky dizaýn meselesi.Şol bir wagtyň özünde, käbir uly markalaryň demir hiliniň ýokdugyny subut edýär, şeýle hem agamyň öň aýdanlaryny subut edýär: Makalanyňyzy goldaýan reagent marka däl.Reagentleriň markasyny öňe süren makalaňyz.Göz öňüne getiriň, eger galyndy reagentleri üýtgetmedik bolsa, nädogry maglumatlar journalurnala iberiler we näme boljakdygy betbagtçylyk bolar.
2. Boş dolandyryşyň Ct bahasy
Düşündirmäň, boş dolandyryşyň Ct bahasy bar bolsa, hapalanma dälmi?Şeýle-de bolsa, haýsy boş dolandyryşyň Ct bahasynyň bardygyna düşünmeli.NTC bolsa, reagent hapalanmagy ýaly daşary ýurt DNK-larynyň bardygyny aňladýar.NRT bolsa, çykarylan RNK-nyň DNK hapalanandygyny aňladýar.
3. Adaty egrilik
Eňňit we hasaplama formulasyny goşmak bilen, PCR netijeliligini formula arkaly hasaplap bolýar.Ajaýyp synag, adaty egriniň eňňidine 3.32, R² bolsa 0.9999 çemeleşmegini talap edýär.
4. Çyzykly dinamiki diapazon
Reaksiýanyň dinamiki diapazony çyzykly.Adaty egrini döretmek üçin ulanylýan şablona görä, dinamiki diapazonda azyndan 5 konsentrasiýa gradiýenti bolmaly we ýokary konsentrasiýa gradiýentlerinde we pes konsentrasiýa gradiýentlerinde Ct bahalarynyň üýtgemegine üns bermeli.
5. ectionüze çykarmagyň takyklygy
QPCR netijeleriniň üýtgemegi, ýagny pes gaýtalanma, ýagny takyk takyklyk, temperatura, konsentrasiýa we iş ýaly köp faktorlar sebäpli ýüze çykýar.qPCR takyklygy, göçürme sanynyň azalmagy bilen köplenç gözegçilik edip bolmaýar.Iň gowusy, eksperimental üýtgeýiş, bu tehniki üýtgeşiklik biologiki üýtgeýşden tapawutlanmalydyr we biologiki köpeltmeler toparlaryň ýa-da bejergileriň arasyndaky qPCR netijeleriniň statistik tapawudyny gönüden-göni çözüp biler.Hususan-da, anyklaýyş gözlegleri üçin, saýtlaryň we operatorlaryň arasynda iň oňat aralyk takyklygy (gaýtalanmagy) habar berilmelidir.
6. ectionüze çykarmagyň netijeliligi we LOD (multiplex qPCR-de)
LOD ýüze çykarylan oňyn nusgalaryň 95% -iniň iň pes konsentrasiýasydyr.Başga sözler bilen aýdylanda, maksatly gen köpeldilen LOD konsentrasiýasy şowsuz reaksiýalaryň 5% -inden geçmeli däldir.Multiplex qPCR derňewi geçirilende, esasanam nokat mutasiýalaryny ýa-da polimorfizmleri bir wagtda ýüze çykarmak üçin, multiplex qPCR, bir turbada köp maksatly bölekleriň takyklygynyň bozulmaýandygyny subut etmeli, köp tapmak we bir turbany kesgitlemegiň netijeliligi we LOD birmeňzeş bolmaly.Esasanam ýokary konsentrasiýaly genler we pes konsentrasiýaly maksatly genler bir wagtyň özünde güýçlendirilende, bu meselä üns berilmelidir.
Meseleler we çözgütlerUmuman aýdanyňda, qPCR çözüwinde köplenç ýüze çykýan meseleler aşakdaky taraplara gönükdirilýär:
· Belli däl güýçlendirme
· Astar konsentrasiýasyny kyn saýlamak we primer ölçegleri bilen kynçylyk
· Anne temperaturasy nädogry
· Ikinji gurluş güýçlendiriş netijeliligine täsir edýär
belli däl güýçlendirme
aýratyn güýçlendirmeýüze çykýar, adatça deslapky dizaýnyň laýyk däldigi hasaplanýar, ýöne primerleri üýtgetmäge howlukmasaňyz, ilki bilen aşakdaky usullary synap bilersiňiz (ýörelge hem goşulýar):
· Anneal temperaturany ýokarlandyrmak - gowşak wodorod baglanyşyklaryny saklap bilmezlige synanyşyň;
· Baglanyş we uzaldyş wagtyny gysgaltmak - gowşak wodorod baglanyşyklaryny azaltmak;
· Astaryň konsentrasiýasyny azaltmak - artykmaç primerleri we maksatly däl sebitleri baglamak mümkinçiligini azaltmak;
Güýçlendirmegiň pes netijeliligi
Specificörite däl güýçlendirmek üçin ters ýagdaý - pes güýçlendirme netijeliligi we pes güýçlendirme netijeliligi bilen baglanyşykly çäreler tersine:
· Baglamak we uzaltmak wagtyny uzaltmak;
· Üç basgançakly PCR-e üýtgetmek we gyzdyrma temperaturasyny peseltmek;
· Astaryň konsentrasiýasyny ýokarlandyrmak;
Ps.Meseläni aňsatlyk bilen çözmek üçin samsyklar gowşak wodorod baglanyşyklaryny siňdirýän faktoryň bardygyny ýa-da ýokdugyny bilmek üçin reagent kompaniýasynyň girişini okamaly bolýarlar.
Astar konsentrasiýasyny kyn saýlamak we primer ölçegleri bilen kynçylyk
1-nji usul: Umuman aýdanyňda, qPCR üçin toplum görkezmeleri ulgamlary maslahat berýär we başlangyç konsentrasiýalary maslahat berýär.
2-nji usul: Esasy konsentrasiýa gradiýentini düzmek arkaly düzediş.Aşakdaky surat görkezmek üçin bir kompaniýadan ogurlanýar.Aşakdaky suratda üç sany esasy konsentrasiýa gradiýenti (100nM, 250nM, 500nM) we dört şablon konsentrasiýa gradiýentleri (0,1ng, 1ng, 10ng, 100ng) bilen öndürilen floresan mukdar netijeleri görkezilýär.Synag netijeleriniň Ct bahasy aşakdaky ýaly meýilleşdirildi:

Esasy konsentrasiýa saýlamasy Her başlangyç konsentrasiýany aşakdaky ýaly birleşdiriň:

Astar konsentrasiýasyny saýlamak düşnüklidir, 100nM we 250nM başlangyç konsentrasiýasynyň çyzykly gatnaşygy has gowudyr we 500nM başlangyç konsentrasiýasynyň çyzykly gatnaşygy birneme pes.100nM we 250nM-de 250nM-iň Ct bahasy birneme kiçi, şonuň üçin iň amatly başlangyç konsentrasiýasy 250nM.Adatça eriş egrisinde agyr primer ölçegleri görünýär.Taslanan primerler primer ölçeglerinden gaça durup bilmese näme etmeli?
3-nji usul: Astarlaryň mukdaryny azaltmak we gyzdyryjy temperaturany ýokarlandyrmak (düşündirmegiň zerurlygy ýok).
Anne temperaturasynyň empirik bahasy 60 ° C.Ynanmasaňyz, has amatly anneal temperaturany nädip saýlamaly?Jogap, başlangyç konsentrasiýany saýlamak bilen deňdir -gradient synagy.Meseläni suratlandyrmak üçin Bio-rad kompaniýasyndan surat alyň.Belli bir nyşan böleklerini güýçlendirmek üçin, hersinde üç gezek gaýtalanýan sekiz temperatura gradiýentini düzüň we alnan güýçlendirme egrisi aşakdaky ýaly:

gyzdyryjy temperaturany saýlamak:
· 70 ° C, 69 ° C - Esasan, desgalary birleşdirip bolmaýar, şonuň üçin güýçlendirme ýok.
· 67.3 ° C - Başda az mukdarda güýçlendirme bar we Ct bahasy birneme uly.
· 64.5 ° C —— Ct bahasy peselýär.
· 60,7 ° C, 58.0 ° C, 56.2 ° C we 55.0 ° C-de Ct bahalary esasan durnukly bolýardy, ýöne soňky floresan bahalary başgaçady.
Nädip saýlamaly?Ipleörelge: Birinji ýörelge has ýokary Ct bahasydyr.Şol bir Ct bahasy üçin, dimerizasiýa we ýörite güýçlendirilmezlik üçin has ýokary gyzdyryjy temperaturany saýlaň.55 ° C-den has ýokary floresan bahasy bar bolsa-da, onda ölçegler ýa-da ýörite däl güýçlendirme bolup biler.
Youöne özüňiz ýaly akylly bolsaňyz, hökman pikirlenersiňiz: Logiki taýdan aýdanyňda, PCR reaksiýasy gaty anyk bolsa, başlangyç konsentrasiýa iň az talapdan ýokary bolsa, ýokary we pes nokatlar, edil floresan boýaglar we dNTP ýaly täsir etmeli däldir.Hakykatdanam, gyzdyryjy temperatura dogry optimizasiýa edilse, başlangyç konsentrasiýanyň Ct bahasyna täsiri tebigy ýagdaýda azaldar.

Düwürtme temperaturasy optimallaşdyrylýar we başlangyç konsentrasiýanyň KT-e täsiri azalýar
Ikinji gurluş güýçlendiriş netijeliligine täsir edýär
Meseläni suratlandyrmak üçin Bio-rad-dan surat alalyň.Şeýle hem ikinji derejeli gurluşly geni güýçlendirmek üçin temperatura gradiýentini düzýär.

Ikinji gurluş ýüze çykýar
Temperatura gradientiniň peselmegi bilen önümler peýda bolup başlaýar we Ct bahasy öňe gidýär, iň pes bahasy 60,7 ° C-e ýetýär, soň bolsa temperatura gradiýenti peselende Ct bahasy ulalýar.Munuň tersine, temperaturanyň ýokarlanmagy bilen ikinji derejeli gurluş açylýar we güýçlendirme netijeliligi ýokarlanýar.Belli bir temperatura ýetenden soň, temperaturany ýokarlandyrmak güýçlendirme netijeliligini ýokarlandyryp bilmez.Sebäbi häzirki wagtda desgalary durnukly birleşdirip bolmaz.Şonuň üçiniň pes Ct bahasy bilen temperaturany gözläň, ikinji derejeli gurluş şablonyny güýçlendirmek üçin iň gowy temperatura!Elbetde, akylly samsyklar zerur däl bolsa, desgalary üýtgedip, ikinji derejeli gurluş sebtinden gaça durmagyň iň gowudygyny bilmelidirler.
5. Arza derejesi
MIQE - Maglumatlaryň derňewi

Maglumatlaryň derňewi esasan floresan mukdar PCR guraly bilen berilýär.Öňki makalada synagyň dizaýnynda düşündirilen boş gözegçilik ýaly köp maglumatlary derňemek işi geçirildi.Içerki salgylanma genleri, gaýtalanýan sanlar we ş.m. aýdyňlaşdyryldy., bu ýerde esasan qPCR ulanylyşyny düşündirýäris.
qPCR giňden ulanylýar we eksperimental barlag we nuklein kislotasynyň diagnozy iň köp ulanylýan senariýadyr.
mutlak mukdar
Log (başlangyç konsentrasiýa) siklleriň sany bilen çyzykly gatnaşyga eýe.Belli başlangyç göçürme belgisi bolan standartdan adaty egrini çekip bolýar, ýagny güýçlendirme reaksiýasynyň çyzykly baglanyşygyny alyp bolýar.Nusganyň Ct bahasyna görä, nusgadaky konsentrasiýa hasaplanyp bilner.Goşmak üçin galyplaryň mukdary.

Mutlak mukdar hasaplamagyň usuly
Mutlak mukdar standart egrä esaslanmalydyr.Adaty egrilik etmek üçin standart talap edilýär.Adatça, standart geni klonlamak arkaly alnan plazmiddir.Näme üçin plazmid?Sebäbi tegelek plazmid DNK iň durnuklydyr.Adaty önümi iki esse (10 esse eritme) laýyklykda 5-6 gradiýentde garyşdyryň we seýreklenende birmeňzeşlige üns beriň.Ct bahasy 15-30 aralygynda düşsün.

Standart taýýarlyk
Şol bir wagtyň özünde, barlanjak nusga hem şoňa görä suwuklandyrylmalydyr (eritme faktoryny ýadyňyzdan çykarmaň) we Ct bahasy hem 15-30 aralygynda bolmaly.Synag edilmeli adaty önüm + nusga bilelikde enjamda goýulýar.Ylgandan soň, adaty madda bilen adaty egrilik edildi we synag ediljek nusgalar konsentrasiýany hasaplamak üçin adaty egrä getirildi.
Gepatit B wirusy HBV mukdary, adaty mutlak mukdar bolup, wirusyň göçürme sanyny 1ml ganda hasaplap bilýär.
Göçürme belgisini hasaplamak
Synag edilmeli nusga konsentrasiýasy (ng / ul) = OD260 × 50ug / ml × eritme faktory
Molekulanyň agramy = esaslaryň sany × 324
Synag ediljek nusganyň göçürme belgisi (nusgalar / ul) = synag ediljek nusganyň konsentrasiýasy / nusganyň molekulýar agramy × 6 × 1014

Göçürme belgisini hasaplamagyň usuly

Aboveokardaky mukdar kesgitlemek üçin hasaplama usulydyr.Bu matematiki mesele, orta mekdebi gutarandan soň çözülip bilner we matematiki meseleler köplenç kompýuterler tarapyndan çözülýär.Düşünmeseňiz, habarlaşyp bilersiňiz.
otnositel mukdar
Deňeşdirme mukdary esasan ylmy gözleglerde ulanylýar.1ml ganda näçe wirus bar we bu DNK wirusy, bu birneme kesgitleýji hadysa: ganyň mukdaryny kesgitläp bolýar we DNK wirusy birneme durnukly.Şeýle-de bolsa, ýaprakdaky belli bir geniň transkripsiýa nusgalarynyň sanyny deňeşdirmek kyn, sebäbi ýapragyň ululygyny, agramyny we näzikligini kesgitlemek kyn, çykarylan RNK mukdaryny kesgitlemek kyn, ters transkripsiýanyň netijeliligini kesgitlemek hem kyn, ýagny islendik ädim tejribe maglumatlarynyň kemçiliklerini döredip biler we ulanyp bolmaz.
Şonuň üçin deňeşdirme mukdary bir elementi girizmeli:içerki salgylanma geni.
Başga sözler bilen aýdylanda, deňeşdirme mukdary maksatly gen bilen içerki salgylanma geniniň arasyndaky deňeşdirme.Şol bir dokumada we şol bir öýjükde deňeşdirilende, nusga ululygynyň täsiri, RNK çykarmagyň mukdary, ters transkripsiýa we PCR netijeliligi birneme az.Nusga ululygy sebäpli içerki salgylanma genleri we maksatly genler birneme azaldy.Şonuň üçin öňem birmeňzeşligi we durnuklylygy nygtap gelýäris.
Içerki salgylanma genleri köplençöý hyzmaty genleri(öý saklaýan genler), ähli öýjüklerde durnukly beýan edilýän genler toparyna degişlidir we önümleri öýjükleriň esasy durmuş işjeňligini saklamak üçin zerurdyr.
Bu düşünjäni bulaşdyrmaň.Öý hyzmaty genleri biologiki funksiýa terminleri, içerki salgylanma genleri eksperimental tehniki adalgalar.Öý hyzmaty genleri içerki salgy genleri hökmünde saýlanmazdan ozal tassyklamadan geçmeli.
Mysal üçin, dürli dokuma öýjüklerinde olaryň aňlatma derejelerini barlamak üçin aşakdaky suratda birnäçe öý hyzmaty genini saýladyk we β-2-mikroglobuliniň aňlatma derejeleriniň beýleki üç geniňkiden düýpgöter tapawutlydygyny, şonuň üçin içerki salgy genleri hökmünde ulanylyp bilinmejekdigini anykladyk.

Içerki salgylanma geniniň düzediş funksiýasyna düşünenimizden soň, içerki salgylanma geniniň girizilmegi sebäpli iki algoritm alynýar.
· Iki standart egrilik usuly
· 2 - t Ct usuly (KT bahasyny deňeşdirmek usuly)
Görnüşleri we gen funksiýalaryny öwrenmek isleseňiz, algoritmler boýunça gözleglerden ýüz öwüriň we formulalary gönüden-göni ulanyň ýa-da maşynlary göni ulanyň;matematika we in engineeringenerçilik ugrundan gönüden-göni ýigit bolsaňyz, arkaýyn boluň.
goşa standart egrilik usuly
Gözegçilik nusgasynyň maksatly genini we öý hyzmaty genini we adaty egriniň üsti bilen synag ediljek nusgany kesgitläň we soňra deňeşdirme derejesini hasaplaýyş formulasyna görä deňeşdiriň.
Üstünlikleri: ýönekeý derňew, has ýönekeý eksperimental optimizasiýa
Adetmezçiligi: Her bir gen üçin synaglaryň her tapgyry adaty egrilik etmeli
Programma: Gen aňlatmagyň kadalaşdyrylyşyny öwrenmekde iň köp ulanylýan we ykrar edilen deňeşdirilen mukdar usullaryndan biri
Formula aşakdaky ýaly:

Mysallar aşakdakylar:

San mukdaryna görä deňeşdirilen mukdary hasaplaň
2 - t Ct usuly (KT bahasyny deňeşdirmek usuly)

Üstünlikleri: Adaty egrilik etmegiň zerurlygy ýok
Adetmezçilikleri: güýçlendirmek netijeliliginiň 100% -e golaýdygy çak edilýär;adaty gyşarmak <5%, adaty egrilik we her güýçlendirmäniň arasyndaky netijelilik yzygiderli hasaplanýar;synag şertleriniň optimizasiýasy has çylşyrymly.
Programma: Gen aňlatmagyň kadalaşdyrylyşyny öwrenmekde iň köp ulanylýan we ykrar edilen deňeşdirilen mukdar usullaryndan biri

Elbetde, güýçlendirmek netijeliligi adatça birkemsiz bolmak mümkin däl 1. Düzediş usuly: Maksatly gen bilen salgylanma geniniň güýçlendiriş netijeliliginiň birmeňzeşdigini bilýän bolsak, ýöne güýçlendirmek netijeliligi 1-e deň däl bolsa, onda 2－ △△ Ct düzedilip bilner: (1 + E) - t Ct, mysal üçin güýçlendiriş netijeliligi 0.95 bolsa, hasaplama formulasy C 1.95－ düzedilip bilner.
Şu wagta çenli floresan mukdar PCR baradaky mazmun gutardy.