Escherichia coli O157: H7 Nuklein kislotasyny kesgitlemek toplumy (PCR floresan gözleg usuly)
Kitiň beýany:
PişikFP102
E. coli O157: H7 iýmitde, iýmitde, suw nusgalarynda we daşky gurşaw nusgalarynda çalt ýüze çykarmak we barlamak üçin ulanylýar.
Düşündirişler
E. coli O157: H7 iýmitde, iýmitde, suw nusgalarynda we daşky gurşaw nusgalarynda çalt ýüze çykarmak we barlamak üçin ulanylýar.
[Synag ýörelgesi]Floresan PCR tehnologiýasy prinsipine laýyklykda, Escherichia coli O157: H7, belli bir primerler we Taqman zondlary, Escherichia coli O157: H7 DNK-nyň hil taýdan ýüze çykarylmagyny amala aşyrmak üçin Escherichia coli O157: H7 geni üçin niýetlenendir we floresan PCR guraly tarapyndan kesgitlenýär.
Kitiň mazmuny
Bellik: ROX kanal barlagy goşulmaýar.
| Ckomponentleri | Spesifikasiýa | Quantity |
| Bufer A. | Tube | 1 |
| Bufer B. | Tube | 1 |
| Oňyn gözegçilik | Tube | 1 |
| Ativearamaz gözegçilik | Tube | 1 |
Garaşylýan ulanyş
Üçin ulanylýar E. coli O157: iýmit, iýmit, suw nusgalarynda we daşky gurşaw nusgalarynda çalt tapmak we barlamak.
Saklamagyň şertleri we möhleti
Garaňkylykda -20 at derejesinde saklaň we doňmakdan we eremekden gaça duruň.
Möhleti 12aýlar we önümçilik senesi daşky gaplamada görkezilýär.
Gurallar we sarp edilýän zatlar
Floresan mukdar PCR gural, turba ýaragy we gabat gelýän maslahatlar, worteks sarsdyryjy, kiçi sentrifuga.
Ulanylyşy
1. Nusga gaýtadan işlemek
1.1 Nusga görnüşi: Bu toplum iýmit, iýmit, suw nusgalary we Escherichia coli O157: H7 bilen hapalanandygyna güman edilýän beýleki nusgalar üçin amatlydyr.Çuňňur gaýtadan işlenen et önümleri, içgiler we pigmentleri öz içine alýan beýleki maddalar üçin, floresan signal ýygnamagyna täsir etmezlik üçin olary ýuwmaly.
1.2 Nusga gaýtadan işlemek: Escherichia coli O157: H7 nusgasyny taýýarlamak, baýlaşdyrmak medeniýeti we izolýasiýasy üçin "GB 4789.10-2016 Azyk howpsuzlygy milli standart iýmit mikrobiologiki barlagy" Escherichia coli O157: H7 Test "-e serediň.
- Nuke kislotasyny çykarmak
1,5 ml sentrifuga turbasynda 20 ml baýlaşdyryş erginini alyň, 200 μL mikrob lizat goşuň (goşmaça toplum gerek), worteks 30 sekunt, sentrifuga gysga we bir gapdalda goýuň.
Bellik: Lizatdan nuklein kislotasyny çykarmak 10 minudyň içinde tamamlanmalydyr we uzak wagtlap saklanyp bilinmez.
3. Nuklein kislotasynyň güýçlendirilmegi
3.1 Ulanmak üçin floresan mukdar PCR guralyny açyň.
Kitapdan bufer A we bufer B, olary gowy erediň we gysga wagtda sentrifuga.Her PCR reaksiýa turbasyna 18 μL Bufer A we 2 μL Bufer B goşuň.Soňra PCR reaksiýa turbalaryna negatiw gözegçiligiň, çykarylan nuklein kislotasynyň we polo positiveitel gözegçiligiň hersine 5 ml goşuň, turbalary ýapyň we sentrifuga gysga wagtlyk goşuň.
3.3 PCR reaksiýa turbasyny floresan PCR maşynyna geçiriň we güýçlendirme synaglaryny geçirmek üçin aşakdaky proseduralary ulanyň: reaksiýa ulgamy üçin 25 ml saýlaň, her sikl üçin 60 ° C derejesinde floresan signallaryny ýygnaň we kesgitlemek kanaly üçin FAM saýlaň.
| Stepdim | Maksatnama | Siklleriň sany |
| 1 | 37 ℃ 5min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3min | 1 |
| 3 | 95 ° C 15s | 4 0 |
| 60 ℃ 30s (floresan ýygnaň) |
Meseleleriň derňewi üçin gollanmalar
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Hiç bir RNK çykaryp bolmaýar ýa-da nuklein kislotasynyň hasyllylygy pes
Adatça dikeldiş netijeliligine täsir edýän köp faktor bar, mysal üçin: RNK mazmuny, iş usuly, elýusiýa göwrümi we ş.m.
Umumy sebäpleriň derňewi ：
1. Işleýän wagtyňyz hammam ýa-da pes temperatura (4 ° C) merkezden gaçyryş.
Teklip: Otagyň temperaturasy (15-25 ° C), hiç haçan buz wannasy we pes temperatura sentrifugasy.
2. Nädogry nusga saklanyşy ýa-da nusga saklanyşy gaty uzak.
Teklip: Nusgalary -80 ° C derejesinde saklaň ýa-da suwuk azotda doňduryň we doňdurmagyň gaýtadan ulanylmagyndan gaça duruň;RNK çykarmak üçin täze ýygnanan nusgalary ulanmaga synanyşyň.
3. ampleterlik nusga lizisi
Teklip: Nusga bilen iş ergininiň (Çyzykly akrilamid) gowy garylyp, otag temperaturasynda (15-25 ° C) 10 minut inkubasiýa edilendigine göz ýetiriň.
4.Eluent nädogry goşuldy
Teklip: Arassalaýyş sütüniniň membranasynyň ortasyna RNase-Free ddH2O goşulandygyna göz ýetiriň.
5. Buffer viRW2-de suwuk etanyň nädogry göwrümi
Teklip: Görkezmelere eýeriň, Buffer viRW2-e suwuk etanolyň dogry mukdaryny goşuň we toplumy ulanmazdan ozal gowy garmaly。
6. Nädogry nusga ulanylyşy.
Teklip: Buffer viRL-den 500μl üçin 200µl nusga.Artykmaç nusga göwrümi RNK çykarmagyň peselmegine getirer.
7. Nädogry elitasiýa göwrümi ýa-da doly däl elitasiýa.
Teklip: Arassalaýyş sütüniniň uzynlygy 30-50μl;elitasiýa effekti kanagatlanarly däl bolsa, öňünden gyzdyrylan RNase-Free ddH goşmak maslahat berilýär2O we otag temperaturasynda 5-10min ýaly wagt goýuň
8.Purifikasiýa sütüninde Buffer viRW2-de ýuwlandan soň etanol galyndysy bar.
Teklip: Bufer viRW2-de ýuwlandan we 2 minut boş turba merkezden gaçyryşdan soň etanol galan bolsa, arassalanan sütün galan etany doly aýyrmak üçin boş turba merkezden gaçyryşdan soň 5 minut otag temperaturasynda galdyrylyp bilner.
Arassalanan RNK molekulalarynyň zaýalanmagy
Arassalanan RNK-nyň hili, nusga saklamak, RNase hapalanmagy we işleýşi ýaly faktorlar bilen baglanyşykly.
Umumy sebäpleriň derňewi ：
1. Theygnalan nusgalar wagtynda saklanmady.
Teklip: Eger nusga ýygnanandan soň ulanylmasa, derrew -80 at ýa-da suwuk azotda saklaň.RNK molekulalaryny çykarmak üçin mümkin boldugyça täze ýygnanan nusgalary ulanmaga synanyşyň.
2.Ygnanan nusgalar doňup, ereýärdi.
Teklip: Nusga ýygnamak we saklamak wagtynda gaýta-gaýta doňdurmakdan we eremekden gaça duruň (ýogsam nuklein kislotasynyň hasyly azalýar).
3.RNase operasiýa otagynda girizildi ýa-da bir gezek ulanylýan ellikler, maskalar we ş.m.
Teklip: RNK molekulalarynyň synagyny çykarmak aýratyn RNK operasiýa otagynda iň oňat ýerine ýetirilýär we tejribe tablisasy synagdan öň arassalanýar.Synag wagtynda bir gezek ulanylýan ellikleri we maskalary geýiň, RNase girizilmegi netijesinde ýüze çykýan RNK zaýalanmazlygy üçin.
4. Reagent ulanylanda RNase bilen hapalanýar.
Teklip: Baglanyşykly synaglar üçin täze Wirus RNK izolýasiýa toplumyny çalyşyň.
5. Merkezden gaçyryş turbalarynyň, turbageçirijileriň we ş.m. RNase hapalanmagy Teklip: Merkezden gaçyryş turbalarynyň, turbalaryň uçlarynyň we turbalarynyň hemmesiniň RNase-ýokdugyna göz ýetiriň.
Arassalanan RNK molekulalary aşaky synaglara täsir etdi
Arassalaýyş sütüni bilen arassalanan RNK molekulalary, duz ionlary ýa-da beloklar gaty köp bolsa, aşakdaky synaglara täsir eder, meselem: ters transkripsiýa, Demirgazyk Blot we ş.m.
1.Saýlanan RNK molekulalarynda duz ionlary bar.
Teklip: Buffer viRW2-e dogry suwly etanolyň goşulandygyna göz ýetiriň we arassalaýyş sütünini iş görkezmelerinde dogry sentrifugasiýa tizligine görä iki gezek ýuwuň still Duz ionlary galan bolsa, arassalaýyş sütünine Buffer viRW2 goşup, otag temperaturasynda 5 minut goýup bilersiňiz.Soňra duz ionlarynyň hapalanmagyny iň ýokary derejede aýyrmak üçin merkezden gaçyryş işini ýerine ýetiriň
2.Saýlanan RNK molekulalarynda galan etanol bar
Teklip: arassalaýjy sütünleriň Buffer viRW2 tarapyndan ýuwlandygyny tassyklandan soň, iş görkezmelerinde merkezden gaçyryş tizligine laýyklykda boş turba merkezden gaçyryş işini ýerine ýetiriň.Etanol galan bolsa, galan etanoly iň ýokary derejede aýyrmak üçin boş turba merkezden gaçyryşdan soň otag temperaturasynda 5 minut goýup bolýar.
Gollanma gollanmalary:
Wirus RNK izolýasiýa toplumynyň görkezmesi
