Merkezi dogmada RNK-nyň DNK bilen beloklaryň arasyndaky transkripsiýa araçydygy hemmelere mälimdir.DNK-nyň tapylmagy bilen deňeşdirilende, RNK-nyň tapylmagy organizmlerde gen aňlatmasyny has obýektiw görkezip biler.RNK bilen baglanyşykly synaglar şulary öz içine alýar: qRT-PCR, RNA-Seq we birleşme genini kesgitlemek we ş.m. RNK-nyň aýratynlyklaryna esaslanyp (RNK-nyň şeker halkasy DNK-nyň şeker halkasyndan has erkin gidroksil toparyna eýe), daşky gurşawda köp sanly RNase bilen bilelikde, RNK durnuksyz we DNK-dan peselmek aňsat.Zibil, zibil, RNK-nyň hili gowy däl bolsa, synag synaglarynyň netijesi kanagatlanarly däl bolmaly, takyk däl maglumatlar ýa-da gaýtalanmazlyk ýaly ýüze çykýar.Şonuň üçin RNK-ny gaýtadan işlemäge has köp üns berilmelidir we indiki synag maglumatlarynyň takyklygyny we takyklygyny üpjün etmek üçin hil gözegçiliginiň baglanyşygy has möhümdir.

RNK-nyň hiline gözegçilik etmek üçin köplenç aşakdaky ulanylýan usullar bar:

• Spektrofotometriýa
• agarose gel elektroforezi
• Agilent Bioanalyzer
• real wagt floresan mukdar PCR
• Kubit floresan boýag usuly

01 Spektrofotometri

RNK goşa baglanyşyklary birleşdirdi we tolkun uzynlygy 260nm.Lambert-Biriň kanunyna görä, RNK konsentrasiýasyny siňdiriş derejesinden 260nm hasaplap bileris.Mundan başga-da, RNK-nyň arassalygyny 260nm, 280nm we 230nm siňdiriş piklerine görä hasaplap bileris.280nm we 230nm degişlilikde beloklaryň we ownuk molekulalaryň siňdiriş derejesi.Hünärli RNK arassalygynyň A260 / A280 we A260 / A230 gatnaşygy 2-den uly bolmaly, eger 2-den az bolsa, bu RNK nusgasynda belok ýa-da ownuk molekulanyň hapalanmagynyň bardygyny we gaýtadan arassalanmalydygyny aňladýar.Hapalanma çeşmeleri, nädogry mukdarda netijelere getirýän PCR reaksiýalarynyň güýçlendirme netijeliligini saklamak ýaly aşaky akym synaglaryna täsir eder.RNK-nyň arassalygy indiki netijelere uly täsir edýär, şonuň üçin spektrofotometriýa, adatça, nuklein kislotasynyň synaglarynda ilkinji ädimde hökmany hil gözegçilik baglanyşygydyr.

Surat 1. Adaty RNK / DNK siňdiriş spektri

02 Agarose gel elektroforezi

Arassalykdan başga-da, RNK-nyň bitewiligi RNK-nyň hiline baha bermek üçin möhüm görkezijilerden biridir.RNK-nyň zaýalanmagy, nusgadaky köp sanly gysga böleklere sebäp bolar, şonuň üçin netijeli kesgitlenip we salgylanma yzygiderliligi bilen örtülip bilinjek RNK bölekleriniň sany azalar.RNK bitewiligini 1% agarose jelinde umumy RNK-nyň elektroforezi bilen barlap bolýar.Bu usul jeli özüňiz düzüp bilersiňiz ýa-da bütewiligi barlamak üçin prefabrik E-Gel ™ ulgamyny ulanyp bilersiňiz.Jemi RNK-nyň 80% -den gowragy ribosomal RNK bolup, köpüsi 28S we 18S rRNA (süýdemdirijilerde) emele gelýär.Gowy hilli RNA degişlilikde 5 Kb we 2 Kb derejesinde 28S we 18S açyk barlary görkezýän iki sany açyk bar görkezer we gatnaşygy 2: 1-e ýakyn bolar.Eger ýaýran ýagdaýynda bolsa, bu RNK nusgasynyň zaýalanmagynyň mümkindigini aňladýar we RNK-nyň hilini hasam barlamak üçin soň beýan edilen usuly ulanmak maslahat berilýär.

Surat 2. Agarose gel elektroforezinde zaýalanan (2-nji zolak) we bitewi RNK (3-nji zolak) deňeşdirme.

03 Agilent Bioanalyzer

RNK-nyň bitewiligini ýönekeý we çalt kesgitlemäge kömek edip biljek ýokarda beýan edilen agarose gel elektroforez usulyna goşmaça, RNK-nyň bitewiligini kesgitlemek üçin Agilent bioanalizatoryny hem ulanyp bileris.RNK konsentrasiýasyna we bitewiligine baha bermek üçin mikrofliidiki, kapilýar elektroforez we floresan kombinasiýasyny ulanýar.Içerki algoritmi ulanyp, RNK nusgasynyň profilini seljermek bilen, Agilent bioanalizeri RNK bitewilik bahasyny, RNK bitewilik belgisini (mundan beýläk RIN diýilýär) hasaplap biler [1].RIN-iň bahasy näçe uly bolsa, RNK-nyň bütewiligi şonça-da ýokarydyr (1-i gaty peselýär, 10-sy iň doly).RNK bilen baglanyşykly käbir synaglar RIN-i hiliň bahalandyrylmagy üçin parametr hökmünde ulanmagy teklip edýär.Mysal hökmünde ýokary geçişli yzygiderli synaglary alyp (mundan beýläk NGS diýilýär), Termo Fişeriň Onkomin panel seriýasynda B öýjük we T öýjükli antigen reseptorlaryny ýüze çykarmak üçin ulanylýan Oncomine ™ adam immun repertuarynyň görkezmeleri, RIN bahasy 4-den uly, has täsirli okalmalar we klonlar bilen ölçenilip bilinjekdigini görkezýär (3-nji surat).Dürli paneller üçin dürli maslahat berilýän diapazonlar bar we köplenç has ýokary RIN has täsirli maglumatlary getirip biler.

3-nji surat, Oncomine ™ Adam immun repertuary synaglarynda, RIN 4-den uly bolan nusgalar has täsirli okalmalary we T öýjük klonlaryny tapyp biler.【2】

Şeýle-de bolsa, RIN bahasynyň käbir çäklendirmeleri hem bar.RIN-iň NGS tejribe maglumatlarynyň hili bilen ýokary baglanyşygy bar bolsa-da, FFPE nusgalary üçin amatly däl.FFPE nusgalary uzak wagtlap himiki taýdan bejerildi we çykarylan RNK, adatça, RIN bahasyna görä pesdir.Şeýle-de bolsa, bu synagyň täsirli maglumatlarynyň kanagatlanarly bolmaly däldigini aňlatmaýar.FFPE nusgalarynyň hiline takyk baha bermek üçin RIN-den başga ölçegleri ulanmalydyrys.RIN-den başga-da, Agilent bioanalyzer DV200 bahasyny RNK hiliniň bahalandyryş parametri hökmünde hasaplap biler.DV200, RNK nusgasynda 200 at güýjünden uly bölekleriň paýyny hasaplaýan parametrdir.DV200, FFPE nusga hiliniň RIN-den has gowy görkezijisidir.FFPE tarapyndan çykarylan RNK üçin, netijeli kesgitlenip bilinjek genleriň sany we genleriň dürlüligi bilen örän ýokary baglanyşygy bar [3].DV200 FFPE-iň hilini kesgitlemekdäki kemçilikleriň öwezini dolup bilse-de, Agilent bioanalizeri henizem RNK nusgalarynda hil meselelerini, şol sanda nusgalarda ingibitorlaryň bardygyny ýa-da ýokdugyny doly seljerip bilmeýär.Inhibitorlaryň özleri aşaky akym synaglarynyň güýçlendirme netijeliligine täsir edip, peýdaly maglumatlaryň mukdaryny azaldyp bilerler.Mysalda inhibitoryň bardygyny ýa-da ýokdugyny bilmek üçin, indiki beýan edilen real wagt floresan mukdar PCR usulyny kabul edip bileris.

04 real wagt floresan mukdar PCR

Hakyky floresan mukdar PCR usuly diňe bir nusgadaky ingibitorlary kesgitläp bilmän, FFPE nusgasyndaky RNK-nyň hilini hem takyk görkezip biler.Agilent biologiki analizatorlary bilen deňeşdirilende, real wagt floresan mukdar gurallary has giň ulanylmagy sebäpli iri biologiki barlaghanalarda has meşhurdyr.RNK nusgalarynyň hilini barlamak üçin diňe GUSB (Pişik no Hs00939627) ýaly içerki salgylanma genleri üçin başlangyç zondlary satyn almaly ýa-da taýýarlamaly.Mutlak mukdar synaglaryny geçirmek üçin bu primerler, zondlar we ülňüler toplumyny (belli konsentrasiýanyň umumy RNK) ulanmak bilen, RNK bölekleriniň täsirli konsentrasiýasy RNK hiliniň bahalandyryş standarty (gysgaça funksional RNA mukdary) hasaplanyp bilner.NGS synagynda, RNK nusgalarynyň FRQ-iň täsirli maglumat göwrümi bilen örän ýokary arabaglanyşygynyň bardygyny gördük.0.2ng / uL FRQ-dan uly ähli nusgalar üçin okalýanlaryň azyndan 70% -i salgylanma yzygiderliligini örtüp biler (4-nji surat).

4-nji surat, floresan mukdar usuly bilen kesgitlenen FRQ bahasy, NGS synagynda alnan täsirli maglumatlar bilen örän ýokary korrelýasiýa (R2> 0.9) bar.Gyzyl çyzyk, 0,2 ng / uL (log10 = -0.7) deň bolan FRQ bahasydyr.【4】

FFPE nusgalaryna ulanmakdan başga-da, hakyky mukdarda PCR usuly, nusgalarda ingibitorlara netijeli gözegçilik edip biler.Içerki poloositiveitel gözegçilik (IPC) we onuň derňewi bilen reaksiýa ulgamyna tapyljak nusgany goşup bileris we Ct bahasyny almak üçin floresan mukdaryny ýerine ýetirip bileris.Mysal üçin, reaksiýada Ct bahasy Ct bahasyndan yza galan bolsa, bu inhibitoryň nusgada bardygyny görkezýär we reaksiýada güýçlendirme netijeliligini saklaýar.

05 Kubit floresan boýag usuly

Kubit florometr, nuklein kislotasynyň konsentrasiýasy we arassalygyny kesgitlemek üçin iň köp ulanylýan kiçijik enjam, işlemek aňsat we her molekulýar biologiýa barlaghanasynda diýen ýaly bar.Nuklein kislotasynyň konsentrasiýasyny takyk kesgitleýär we nuklein kislotasyny baglanyşdyrýan floresan boýagy (Kubit kesgitleýji reagenti) kesgitleýär.Kubit ýokary duýgurlyga we aýratynlyga eýedir we RNK-ny pg / µL konsentrasiýasyna çenli takyk kesgitläp biler.Nuklein kislotasynyň konsentrasiýasyny takyk kesgitlemek ukybyna goşmaça, Termo Fişeriň iň soňky täze modeli Qubit 4.0 hem RNK-nyň bitewiligini kesgitläp biler.Qubit 4.0′s RNK kesgitlemek ulgamy (RNA IQ Assay), bir wagtyň özünde iki sany floresan boýagy anyklamak bilen RNK-nyň bitewiligini kesgitleýär.Bu iki floresan boýag, degişlilikde uly böleklere we RNK-nyň ownuk böleklerine baglanyp biler.Bu iki floresan boýag, nusgadaky RNK-nyň uly bölekleriniň paýyny görkezýär we şondan RNK hilini görkezýän IQ (Integrity and Hil) bahasy hasaplanyp bilner.IQ bahasy FFPE we FFPE däl nusgalara hem degişlidir we indiki yzygiderliligiň hiline uly täsir edýär.NGS synaglaryny mysal hökmünde alyp, Ion torrent ™ platformasynda geçirilen RNA-Seq synag synaglarynda IQ bahasy 4-den uly bolan nusgalaryň köpüsinde azyndan 50% täsirli okaldy (5-nji surat).Ubokarda agzalan kesgitleme usullary bilen deňeşdirilende, Qubit IQ Assay diňe bir işlemek üçin has amatly däl we az wagt alýar (bäş minudyň içinde), ölçenen parametr IQ bahasy bilen aşaky synaglaryň maglumat hiliniň arasynda hem uly baglanyşyk bar.

5-nji suratda, Qubit RNA IQ bahasy bilen RNA-Seq-iň kartalaşdyrylan okalmalarynyň arasynda uly baglanyşyk bar.【5】

Aboveokardaky giriş arkaly, her kimiň dürli RNK hiline gözegçilik usullaryna ýeterlik derejede düşünýändigine ynanýaryn.Iş ýüzünde, saýlap bilersiňiznusga görnüşine we bar bolan gurallara laýyklykda degişli usul.Diňe RNK hiline gözegçilik etmek bilen, pes nusga hiliniň netijesinde ýüze çykan indiki synaglaryň şowsuzlygynyň öňüni alyp bileris, şeýlelik bilen gymmatly wagty, güýji we çykdajylary tygşytlap bileris.

Salgy önümleri:

Haýwanlaryň jemi RNK izolýasiýa toplumy

Öýjükleriň jemi RNA izolýasiýa toplumy

salgylanmalar

【1】 Şröder, A., Mueller, O., Stoker, S. we ş.m.RIN: RNK ölçeglerine bitewilik bahalaryny bellemek üçin RNK bitewilik belgisi.BMC molekulýar biol 7, 3 (2006).https:// doi .org / 10.1186 / 1471-21 99-7-3

【2】 Onkomine adam immun repertuarynyň ulanyjy gollanmasy (Pub. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】 Leah C Wehmas, Çarlz E Wud, Braýn N Çorli, Karol L ukauk, Geýl M Nelson, Sýuzan D Hester, Arhiw Formalin bilen berkidilen parafin bilen örtülen dokma nusgalary, toksikologiýa ylymlary, tom 170, 2-nji awgust, 3537-nji sahypa, 357-nji sahypahttps://doi.org/10.1093/toxsci/