Ectionüze çykarmagyň aýratynlygy

Köplenç başlangyç dizaýnyň maksady PCR-iň aýratynlygyny ýokarlandyrmakdyr.Bu köp üýtgeýänleriň has az ýa-da az öňünden aýdyp boljak täsiri bilen kesgitlenýär.Möhüm üýtgeýjileriň biri, primeriň 3′endindäki yzygiderlilikdir.

Möhüm zat, aýratynlyk üçin döredilen PCR analizleri giň dinamiki diapazonda ýokary netijeliligi saklamagy has ähtimal, sebäbi analiz güýçlendirme önümlerini öndürmeýär, şeýlelik bilen PCR reagentleri bilen bäsleşýär ýa-da esasy güýçlendirme reaksiýasyny saklaýar.

Elbetde, käbir ýagdaýlarda aýratynlyk iň möhüm däl, mysal üçin, maksat ýakyn baglanyşykly, ýöne dürli patogenleri kesgitlemek bolanda, ýörite dizaýn, optimizasiýa we barlamak standartlary talap edilýär.

Ereýän egri amplikonlaryň aýratynlygyna baha bermek üçin iň bolmanda bir nyşany güýçlendirmek ýa-da ýokarlandyrmak nukdaýnazaryndan baha bermek üçin adaty usuldyr.Şeýle-de bolsa, ereýän egrileriň ýalňyş bolup biljekdigini bellemek gerek, sebäbi, mysal üçin, suboptimal primerleriň we pes şablon konsentrasiýalarynyň bilelikdäki täsirleri olara täsir edip biler.

P5 |Ereýän egrilik, dürli maksatly DNK-laryň dürli mukdaryny kesgitlemekden alnan Tm çalşyklaryny görkezýär.

A. Has ýokary konsentrasiýalarda (mahabat), qPCR ölçegi gutarandan soň aç-açan başlangyç ölçeg ýok.Şablonyň konsentrasiýasy 50 nusga (e) çenli azalýarka, belli bir önüm peýda bolup başlaýar we iň pes konsentrasiýada (f) ýeke-täk önüm bolýar.

B. Synag, ähli maksat konsentrasiýalarynda şol bir Tms-i hasaba aldy we iň pes konsentrasiýada-da (5 nusga) aç-açan başlangyç ölçeg ýokdy.Bu iki kesgitleme usuly ulanylanda, NTC-lerde güýçlendiriji önüm tapylmady.

P5, şablonyň dürli konsentrasiýalarda bar bolan nusgalary bilen alnan eriş egrilerini görkezýär.P 5a iň pes iki konsentrasiýada öndürilen, güýçlendirilmedik önümleriň Tms-iň belli amplikonlardan pesdigini görkezýär.

Elbetde, bu kesgitleme usuly pes konsentrasiýalarda bar bolan nyşanlary kesgitlemek üçin ygtybarly ulanylyp bilinmez.

Gyzykly tarapy, NTC-ler, ýagny aslynda DNK ýok nusgalar, fon genom DNK-nyň aýratyn güýçlendirme / polimerizasiýa gatnaşyp biljekdigini görkezýän güýçlendiriji önümleri ýazga geçirmedi.

Käwagt şular ýaly fon desgalary we ýörite däl güýçlendirme düzedip bolmaýar, ýöne köplenç haýsydyr bir şablon konsentrasiýasynda we NTC (P 5b) aýratyn güýçlendirme ýok kesgitleme usulyny düzmek bolýar.

Bu ýerde, hatda Cq 35 bilen maksat konsentrasiýasynyň güýçlendirilmegini ýazga almak hem belli bir eriş egrisini döreder.Şonuň ýaly-da, NTC-ler aýratyn güýçlendirme alamatlaryny görkezmediler.Käwagt ýüze çykarmak häsiýeti ene içgisine bagly bolup biler we dürli Mg2 + konsentrasiýalary bilen baglanyşykly bolup bilýän käbir bufer kompozisiýalarynda diňe ýörite däl güýçlendirme ýüze çykarylýar.

Ectionüze çykarmagyň durnuklylygy

Ta-nyň optimizasiýasy, qPCR tapmagyň empirik barlamak we optimizasiýa prosesinde peýdaly ädimdir.NTC güýçlendirmezden iň pes Cq öndürýän temperaturany (ýa-da temperatura diapazonyny) görkezip, primeriň berkligini gönüden-göni görkezýär.

Duýgurlygyň iki-dört esse tapawudy ýokary mRNA aňlatmasy bolan adamlar üçin möhüm bolup bilmez, ýöne anyklaýyş synaglary üçin polo positiveitel we ýalan netijeleriň arasyndaky tapawudy aňladyp biler.

QPCR primerleriniň Ta häsiýetleri dürli-dürli bolup biler.Käbir synaglar gaty ygtybarly däl we primerleriň optimal Ta bahasy boýunça ýerine ýetirilmese, çalt ýykylar.

Bu möhümdir, sebäbi tapmagyň bu görnüşi hakyky dünýäde köplenç kynçylyk döredýär we nusganyň arassalygy, DNK konsentrasiýasy ýa-da başga DNK-nyň bolmagy optimal bolup bilmez.

Mundan başga-da, maksatly göçürme belgisi dürli görnüşde üýtgäp biler we reagentler, plastmassa gap-gaçlar ýa-da gurallar synag gurlanda ulanylýanlardan tapawutly bolup biler.

P6 | Temperatura gradienti PCR kesgitlemegiň dürli berkligini görkezýär.

A. Adam beýnisiniň RNK-dan taýýarlanan CDNA-da PCR ýerine ýetirmek üçin Bioliniň Sensifast SYBR mastermiksini (katalog belgisi BIO-98050) ulanyň.

B. Bio-Rad-yň CFX qPCR guralyny ulanyp, apaliniň güýçlendirme kartasyny we eriş egrisini ýazga alyň (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. ACSBG1 güýçlendirme grafigi we ereýän egrisi (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. GFAP-yň güýçlendirme grafigi we dargamak egrisi (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs, 7C temperatura gradientinde ýazylan Cq tapawudyny görkezýän dürli anneal temperaturalarda hasaba alyndy.

P 6 islenmeýän synagyň adaty netijesini görkezýär, bu ýerde qPCR 59C bilen 67C (P 6a) aralygyndaky gradiýent Tas ulanyp, adam beýnisine mahsus üç gen üçin primer ulanyp ýerine ýetirildi.

Güýçlendirmek grafiginden Opalin primerleriniň idealdan uzakdadygyny görmek bolýar, sebäbi iň amatly Ta diapazony gaty dar (6b surat), ýagny Cqs giň ýaýrandyr, netijede Cqs optimal Cqs Pes bilen deňeşdirilende ep-esli deňeşdirilýär.

Bu kesgitleme usuly durnuksyz we suboptimal güýçlendirilmegine sebäp bolup biler.Şonuň üçin bu jübüt primerleri täzeden dizaýn etmeli.Mundan başga-da, ereýän egrilik derňewi (inset) bu kesgitleme usulynyň aýratynlygynyň hem kynçylyk çekip biljekdigini görkezýär, sebäbi her Ta-nyň ereýän egrisi başga.

P 6c-de görkezilen ACSBG1 kesgitlemek usuly ýokardaky Opalini kesgitlemek usulyndan has ygtybarly, ýöne henizem idealdan uzakda we kämilleşdirilmegi mümkin.

Şeýle-de bolsa, berklik bilen aýratynlygyň arasynda zerur baglanyşygyň ýokdugyny belläris, sebäbi bu kesgitleme usuly bilen öndürilen eriş egrisi ähli Tas (inset) -de iň ýokary bahany görkezýär.

Beýleki tarapdan, berklik synagy has çydamly bolup, P 6d-de görkezilen GFAP synagynda bolşy ýaly Tasyň giň toparynda şuňa meňzeş Cq öndürýär.

Şol bir 8 gradus Selsiýada alnan Cqs tapawudy 1-den pesdir we eriş egrisi (inset) bu temperatura diapazonyndaky kesgitleme aýratynlyklaryny tassyklaýar.Hasaplanan Tas bilen hakyky Ta diapazonynyň başgaça bolup biljekdigini bellemelidiris.

Gözlegçileriň netijeli primerleri dizaýn etmegine kömek etmek üçin döredilen köp görkezmeler bar, köpüsi uzak wagtlap kesgitlenen düzgünlere esaslanýar we primerleriň 3-nji bölegine köp üns berildi.Köplenç G ýa-da C-ni 3 'ujuna we iki sany G ýa-da C bazasyny (GC gysgyç) goşmak maslahat berilýär, ýöne soňky 5 bazanyň ikisinden köp bolmaly däl.

Iş ýüzünde bu düzgünler gözlegçilere ýol görkezip biler, ýöne ähli şertlerde hökman dogry däl.

P7 |Astaryň 3-nji ugry aýratynlyga ýa-da netijelilige az täsir edýär.

A. Adam HIF-1α (NM_181054.2) geni üçin desgalaryň ýagdaýy.

B. Alty synag elementini güýçlendirmek üçin Agilent Brilliant III SYBR Greenaşyl ene içgisini (Cat. 600882) ulanyň.

C. Bio-Rad-yň CFX qPCR guraly we 3′end primerleri tarapyndan ýazylan güýçlendirme grafigi we ereýän egri.NTC-ler gyzyl reňkde görkezilýär.

D. Cqs her synag elementiniň ýazgysy

Mysal üçin, P 7-de netije 3′end düzgünine ters gelýär.Designhli dizaýnlar, esasan, birmeňzeş netijeleri berýär, diňe iki sany esasy kombinasiýa, NTC-de ýörite däl güýçlendirme getirýär.

Şeýle-de bolsa, GC klipiniň täsirini goldap bilmeris, sebäbi bu ýagdaýda A ýa-da T-ni iň köp 30 esas hökmünde ulanmak aýratynlygy peseltmeýär.

F primeri GGCC-de gutarýan C synagy, 30-dan soň bu yzygiderliliklerden gaça durmak isleýändigini görkezýän NTC-lerde Cqs ýazdy.Esasy jübütiň iň gowy 3′end yzygiderliligini kesgitlemegiň ýeke-täk ýolunyň käbir dalaşgärleriň başlangyç synaglaryna baha bermekdigini belläris.

Güýçlendirmek netijeliligi

Möhüm zat, ýörite däl PCR kesgitlemesi hiç haçan kesgitli bolup bilmese-de, fermenti, ene içgisini, goşundylary we welosiped şertlerini üýtgetmek arkaly güýçlendirme netijeliligini köp dürli usullar bilen düzedip we ulaldyp bolýar.

PCR kesgitlemegiň netijeliligine baha bermek üçin maksatly nuklein kislotasynyň 10 ýa-da 5 esse, ýagny “adaty egrilik usuly” yzygiderli eritmesini ulanmak iň gowusydyr.

PCR amplikonlary ýa-da sintetiki DNK nyşanlary adaty egrilik döretmek üçin ulanylsa, bu nyşanlaryň yzygiderli erginleri yzygiderli fon DNK (genom DNK) bilen garylmalydyr.

P8 |PCR-iň netijeliligini bahalandyrmak üçin eriş egri.

A. HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA we R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC we PCR we ereýän egrilik şertleri üçin Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (katalog belgisi 600882) üçin primerleri ulanyň.

B. 100 ng RNK tersine transkripsiýa edildi, 2 gezek suwuklandy we yzygiderli suwuklandyrylan CDNA nusgalary adam genom DNK-syna 5 gezek suwuklandyryldy.Eremegiň egrisi insetde görkezilýär.

C. RT reaksiýasy, eritme we yzygiderli eritme ikinji cDNA nusgasy üçin gaýtalandy we netijeler meňzeşdi.

P 8 iki dürli cDNA nusgasynda birmeňzeş kesgitleme usulyny ulanyp, iki sany egrini görkezýär, netije şol bir netijelilik, takmynan 100%, R2 bahasy hem meňzeş, ýagny synag synaglary bilen regressiýa çyzygynyň ýa-da maglumatlaryň çyzyk derejesi.

Iki adaty egrini deňeşdirip bolýar, ýöne düýbünden birmeňzeş däl.Maksat nyşany takyk kesgitlemek bolsa, näbelliligi düşündirmezden göçürme san hasaplamasyny bermegiň kabul edilip bilinmejekdigini bellemelidiris

P9 |Adaty egrini ulanyp mukdar bilen baglanyşykly ölçeg näbelliligi.

A. PCR we ereýän egrilik şertlerini ýerine ýetirmek üçin GAPDH (NM_002046) üçin primerleri ulanyň.F: ACAGTTGCCATGTAGACC we R: TAACTGGTTGAGCACAGG we Bioliniň Sensifast SYBR mastermiksi (katalog belgisi BIO-98050).

B. Güýçlendirmek diagrammasy, eriş egri we Bio-Rad-yň CFX qPCR guraly bilen ýazylan adaty egrilik.

C. Adaty egrilik grafigi we 95% ynam aralygy (CI).

D. Göçürme belgisinden we üç Cq bahasynyň 95% ynam aralygy.

P 9, optimallaşdyrylan synag üçin, ýekeje standart egriniň mahsus üýtgeýşiniň takmynan 2 esse (95% ynam aralygy, iň pesden iň ýokary) bolup biljekdigini görkezýär, bu garaşylýan iň kiçi üýtgeşiklik bolup biler.

Degişli önüm:

Öýjük göni RT qPCR toplumy

Syçan guýrugy göni PCR toplumy

Haýwan dokumasy göni PCR toplumy