RT-qPCR synagynda RNK çykarmak we hil taýdan baha bermek, ters transkripsiýa we qPCR üç ädim bar, her ädimde köp ätiýaçlyk çäreleri bar, aşakda jikme-jik maglumat bereris.

Ⅰ.RNK hiline baha bermek

RT-qPCR synagynda, RNK çykarmak tamamlanandan soň, RNK-nyň hiline baha berilmeli we indiki synag diňe hünärli bolandan soň geçirilip bilner.Bahalandyryş usullary spektrofotometr, Agilent gel elektroforezi, Agilent 2100 derňewini öz içine alýar, şolaryň arasynda iň köp ulanylýan spektrofotometr we agarose gel elektroforez usulyny kesgitlemek.RNK-nyň hilini üpjün etmek üçin RNK konsentrasiýasyny, arassalygyny we bitewiligini ýüze çykarmak we seljermek üçin bu iki usulyň bilelikde ulanylmalydygyny bellemelidiris.

Baglanyşykly RNK izolýasiýa toplumy: 

Öýjükleriň jemi RNA izolýasiýa toplumy

Lyokary arassalanan we ýokary hilli jemi RNK dürli medeniýetli öýjüklerden 11 minutda alyp bolýar.

Haýwanlaryň jemi RNK izolýasiýa toplumy

Dürli haýwan dokumalaryndan ýokary arassalygy we ýokary hilli jemi RNK-ny çalt we täsirli çykaryň.

Spektrofotometr:

Spektrofotometr esasan RNK-nyň konsentrasiýasyny we arassalygyny kesgitlemek üçin ulanylýar, ýöne RNK-nyň we genom galyndysynyň bitewiligini kesgitläp bilmeýär.Olaryň arasynda A260 / 280 we A260 / 230 RNK arassalygyny kesgitlemek üçin möhüm parametrler bolup, RNK arassalygyny bahalarynyň üýtgemegine görä kesgitläp bolýar:

1. RNK arassalygynyň gowydygyny görkezýän 1.9 2.1, RNK-nyň bölekleýin zaýalanmagyny görkezýär, muny agarose gel elektroforezi bilen tassyklap bolýar.

2. RNK arassalygynyň gowydygyny görkezýän 2.0

Agarose gel elektroforezi:

Agarose gel elektroforez barlagy RNK bitewiligini, gen we belok galyndylaryny seljerip biler, ýöne RNK konsentrasiýasyny takyk kesgitläp ýa-da organiki reagentleriň galyndylaryny kesgitläp bilmez.Mysal üçin eukariotik RNK şablonlaryny alyň:

1. RNK agarose gel elektroforezine sezewar edildi.Gel kartasynda diňe 28sRNA, 18sRNA we 5.8sRNA üç sany ýeke zolak bar bolsa, bu çykarylan RNK-nyň üýtgemändigini görkezýär.Süýremek hadysasy bar bolsa, bu RNK-nyň bölekleýin zaýalanmagyny görkezýär.

2. theelim deşik bilen 28sRNA zolagyň arasynda ýekeje ýagty zolak bar bolsa, genom DNK galyndylary bolup biler.

3. theelim deşikde zolaklar peýda bolsa, belokyň we beýleki makromolekulýar maddalaryň galyndylarynyň bolup biljekdigini görkezýär.

Ⅱ. Tersine transkripsiýa

RNK çykarmak tamamlanandan soň, indiki synaglar üçin cDNA-a öwrülmeli, şonuň üçin tersine ädim ätmeli.Ters transkripsiýa we primer saýlanylanda ters transkripsiýa giriziler:

Tersine transkriptaz saýlamasy:

Adaty ters ýazgylara AMV RTase we MMLV RTase girýär.AMV RTase-iň RNase H güýçli işjeňlige, gysga sinteziň uzynlygyna, pes sintez mukdaryna we gowy ýylylyk durnuklylygyna eýe (42 ~ 55 ℃).MMLV RTase-nyň RNase H işjeňligi gowşak, sinteziň uzynlygy, sinteziň mukdary köp we ýylylyk durnuklylygy pes (37 ~ 42 ℃).

RNase H fermentiniň RNK şablonyny peseltmek funksiýasyna eýe bolany üçin, tersine transkripsiýa wagtynda gowşak RNase H işjeňligi bolan MMLV saýlanylmaly we soňraky genetiki in engineeringenerçilikden soň MMLV-iň ýylylyk durnuklylygy ýokary böküşe ýetdi.Foregene almakForeasy ters transkriptaz (ters transkripsiýa üçin M-MLV) Mysal üçin, genetiki rekombinasiýa tehnologiýasyny ulanyp, E. coli ineredenerli bakteriýalarynda aňladylan täze ters transkriptaz.Bu bir hatar RNK, DNK ýa-da RNK: DNK gibridinden goşmaça DNK simini sintez edýän rekombinant DNK polimeraza.Onda RNase H işjeňligi, güýçli durnuklylygy, güýçli RNK ýakynlygy we ýokary kesgitleme duýgurlygy ýok.

 

Foreasy ters transkriptaz (ters transkripsiýa üçin M-MLV)

Astar saýlamak:

Adatça RT primerleri üç kategoriýa bölünýär: oligo dT, tötänleýin primerler we genlere mahsus primerler.Dürli synag synag talaplaryna laýyklykda ulanmak üçin amatly desgalary saýlaň.

1. Şablon eukariotik gelip çykyşy bolsa we giçki CDNA PCR güýçlendirmek üçin ulanylsa, Oligo (dT) maslahat berilýär;Soňky synag diňe qPCR üçin ulanylsa, tersine transkripsiýanyň netijeliligini ýokarlandyrmak üçin Oligo (dT) tötänleýin primerler bilen garylmagy maslahat berilýär.

2. Şablon prokaryotlardan bolsa, ters transkripsiýa üçin tötänleýin primerler ýa-da gen aýratyn primerleri saýlamaly.

Ⅲ.qPCR

Floresan mukdary, esasan, mukdar usullaryny, başlangyç dizaýn ýörelgelerini, ROX saýlamasyny, reaksiýa ulgamynyň konfigurasiýasyny we reaksiýa şertlerini kesgitlemek we ş.m.

San usullaryny saýlamak:

Mukdar usullary degişlilikde mukdar usullaryna we mutlak mukdar usullaryna bölünýär.Käbir bejeriş usullarynyň gen aňlatmagyna täsirini kesgitlemek, dürli wagtda gen aňlatmagyň tapawudyny kesgitlemek we dürli dokumalarda gen aňlatmagyň tapawudyny deňeşdirmek üçin deňeşdirme mukdary ulanylyp bilner.Mutlak mukdarda wirusdaky nuklein kislotasynyň mukdaryny we ş.m. kesgitläp bolýar.Synaglar geçirilende, öz synaglarymyza görä degişli mukdar usullaryny saýlamalydyrys.

Esasy dizaýn ýörelgeleri:

QPCR üçin primeriň dizaýny güýçlendirme netijeliligi we önümiň aýratynlygy bilen gönüden-göni baglanyşyklydyr.Şonuň üçin gowy primerleri dogry dizaýn etmek üstünlikli qPCR-iň ilkinji ädimidir.Astaryň dizaýnynda adaty primer dizaýnynyň ýörelgesine laýyk gelende aşakdaky ýörelgelere üns berilmelidir:

1. Maksat bölekiniň uzynlygy 100 bilen 300 at aralygynda dolandyrylýar;

2. Genomiki DNK-nyň täsirinden gaça durmak üçin kross-dizaýn;

3. Taslanan desgalary güýçlendirmek netijeliligi üçin barlamaly we diňe güýçlendiriş netijeliligi standartlara (90-110%) ýetende mukdar synaglary üçin ulanylyp bilner;

4. Esasy konsentrasiýa, adatça 0.1uM bilen 1.0uM arasynda optimallaşdyrylýar.

SaýlamakROX:

San taýdan reaksiýa prosesinde ROX optiki ýol tapawudyny, bugarmak we kondensasiýa sebäpli ýüze çykýan ýalňyşlyk ýa-da ses tapawudyny sazlap, netijeleriň gaýtalanmagyny gowulandyryp biler.Şeýle-de bolsa, ROX-yň saýlanylmagynyň gural bilen baglanyşyklydygyny bellemelidiris.QPCR guralynyň deşikleriň arasyndaky tapawudy awtomatiki düzetmek funksiýasy bar bolsa, ROX goşmagyň zerurlygy ýok;bolmasa, ROX düzediş goşmaly.Reagentleri satyn almakda kiçi hyzmatdaşlar dogry ROX saýlamak, soňraky ýalňyşlyklardan gaça durmak üçin ulanylýan gural boýunça bolmaly.

Reaksiýa ulgamyny taýýarlamak:

20ul we 50ul reaksiýa göwrümleri makul bilner.Ulgam düzülende aşakdaky meselelere üns berilmelidir:

1. Reaksiýa ulgamy, aşa arassa iş ýerinde, täze ddH-de howa çalşygy bilen taýýarlanmalydyr₂O her synag üçin ulanylýar;

2. Her bir synag ulgamda hapalanmanyň bardygyny ýa-da ýokdugyny barlamak üçin NTC taýýarlamaly, ulgam taýýarlanylanda her jübüt primer NTC etmeli;

3. RNK şablonynda gDNA galyndysynyň bardygyny ýa-da ýokdugyny anyklamak üçin, her bir nusga üçin NRT taýýarlanyp bilner;

4. Ulgam taýýarlanylanda, bir nusga üçin azyndan 3 tehniki gaýtalamak maslahat berilýär;

5. Şablon cDNA bolanda, ters transkripsiýa ulgamynyň qPCR synagynda päsgelçilik täsirini azaltmak üçin 5-10 gezek eritmek maslahat berilýär.Şablonyň mukdaryny gradient boýunça öwrenmek has gowudyr, şonuň üçin KT bahasy 20-30 aralygynda düşer;

6. Gerekli reaksiýalary kesgitläň, reaksiýalaryň sanyna görä 5-10% köpeliň we ses konfigurasiýa sanyny hasaplaň;

7, ulgam sentrifugadan soň garyşyp, köpürjikleriň bolmazlygyny üpjün etmek üçin premiks ýörelgesini ulanyp taýýarlanýar;

8, Mümkin boldugyça sarp edilýän materiallary saýlamak.

Baglanyşykly RT-qPCR toplumy