Her kim qRT-PCR eksperimenti, deslapky dizaýn, netijeleri düşündirmek we ş.m. prinsipi barada gürleşýär, ýöne men siziň bilen qRT-PCR synag synagyny paýlaşaýyn öýdýärin.Bu kiçijik, ýöne netijeler hakda.

“QRT-PCR” etmezden ozal öz RNK-larymyz we iş usullarymyz barada aýdyň düşünmelidiris.Galyberse-de, biziň tagallalarymyz diňe bir tejribe däl-de, netijeleri gazanmaga gönükdirilendir.Şonuň üçin qRT-PCR etmezden ozal aşakdaky meseleleri kesgitlemeli (käbirleri diňe SYBR üçin ulanylýar).

1 RNK-iňiziň bozulmaýandygyna ynanýarsyňyzmy?

NanoDrop 2000 diňe RNK-nyň konsentrasiýasyny we arassalygyny kesgitläp bilýär, ýöne RNK-nyň bitewiligini kesgitläp bilmeýär.

RNK (RNA Intesity Number) bahasy, Agilent 2100 Bioanalyzer ulgamy tarapyndan ýüze çykarylan RNK-nyň bitewiligini görkezip biler.

Dürli RNK nusgalary üçin RIN bahalarynyň shemasy (eukariotlar)

Şeýle-de bolsa, barlaghanalarda adatça Agilent 2100 Bioanalyzer ýok.Bu ýagdaýda formaldegid jeli arkaly kesgitläp bileris, ýöne RNK-nyň umumy mukdaryna bolan talap köp, şonuň üçin iň çalt usul adaty gel elektroforezini ulanmakdyr.Nukleizsiz gurşawda bolmak talap edilýär, şonuň üçin elektroforez tankyny, çüýşäni, jel kysymyny we taragyny DEPC suwy bilen ýuwmaly.Agaroza hem nukleuzsyz (täze açylança) we adingükleme buferi mümkin boldugyça 1,2% jel bilen täze açylmalydyr.

Geliň doly eremelidigine üns beriň, ýogsam suratda 9-njy nusgada görkezilişi ýaly birmeňzeş zolaklara sebäp bolar.Naprýatageeniýe gaty ýokary bolsa ýa-da gaty uzak işlese, ýylylyk döreder we RNK-nyň zaýalanmagyna sebäp bolar, şonuň üçin naprýa .eniýe we wagt ýeterlik derejede gözegçilik edilmelidir.Mundan başga-da, jeliň işlemegi nusgada DNK galyndysynyň bardygyny ýa-da ýokdugyny kesgitläp biler we paýlaýyş guýusynda köp sanly saklanylýan zolaklaryň bardygyny ýa-da ýokdugyny synlap biler.

Surat.Geliň elektroforezi RNK-ny anyklamak

2 CDNA-nyň konsentrasiýasyna ynamyňyz barmy?

Laboratoriýadaky uly doganlaryň tejribesi, her inwersiýa arkaly alnan 20 ul ulgamynyň cDNA-sy gönüden-göni 20X, doktorlykdan soňky uýalar 10X suwuklandyrylýar.Men köplenç ýagdaýa bagly.Her bir adamyň bellän RNK-nyň hili dürli-dürli bolansoň, terslik derejesi hem başga, tersine tehnologiýa durnuksyz bolup biler.

Şonuň üçin her gezek tersine CDNA alanymda, ilki bilen takmynan 3 gezek eriterin, soň bolsa RT-PCR etmek üçin öý hyzmaty genini ulanaryn, siklleriň sany, adatça, 25 aýlaw bolup, belli bir konsentrasiýany kesgitlär, soň bolsa iň soňky eritme faktoryny kesgitlär.

3 Primerleriňizi ulanmagyň aňsatdygyna ynanýarsyňyzmy?

QRT-PCR-iň ereýän egrisini geçip biler, ýöne bu henizem pul talap edýär.Köp pulsyz barlaghanalar üçin, köp primer alanda, adaty bir RT-PCR ulanyp, onuň bir zolakdygyny ýa-da primerleriň aýratynlygyny kesgitläp bilerler.Laboratoriýada pul ýetmezçilik etmese, ähli primerleriň aýratynlygyny ereýän egriniň üsti bilen kesgitläp bolýar.

4 Synag şertleriňiziň laýykdygyna ynanýarsyňyzmy?

SYBR güýçli yşykdan goralmalydyr, şonuň üçin SYBR reagentini goşanyňyzda üstündäki çyrany öçürmäge synanyşyň we ony tamamlamak üçin diňe çyrany ulanmaly.

SYBR-y 4 ° C derejesinde saklaň.Ulanylanda köpüklenmezlik üçin gowy garyşmak üçin ýuwaş-ýuwaşdan ýokaryk we aşak öwüriň we güýçli gyşarmaň.

Käbir kiçi uýalar, nusgalary garyşdyrmakdan gorkup, PCR tagtasynda bellik çyzmagy halaýarlar, bu nädogry.Markerleriňiziň floresan signallaryň ýygnalmagyna täsir etmegi gaty ähtimal, men adatça ýetginjeklere aşakda görkezilişi ýaly ýadyňyza kömek etmek üçin tejribe depderçelerini ulanmagy maslahat berýärin.

Surat.qRT-PCR nusga ýükleme diagrammasy

5 Dogry edýändigiňize ynanýarsyňyzmy?

Ellik geýiň, ellik geýiň, ellik geýiň we möhüm zatlary üç gezek aýdyň.

SYBR-yň ýagtylyga täsirini azaltmak üçin, aşakdaky suratda görkezilişi ýaly ilki bilen bir şablon goşmagy halaýaryn.Tejribe görä, az mukdarda şablonyň goşulmagy, nusga alma ýalňyşlyklaryna sebäp bolup biler.Şonuň üçin az mukdarda şablon goşmak bilen ýüze çykan ýalňyşlygy azaltmak üçin, adatça nusgany iki esse köpeldýärin we goşulan H2O2 mukdaryny azaltmak üçin nusga goşanymda iki esse köpeldýärin.

Surat.QRT-PCR ýüklemegiň shemasy

Soňra qRT-PCR ulgamyny aşakdaky ýaly düzüň.

Surat.qRT-PCR ulgamy taýýarlamak diagrammasy

BELLIK: Sazlama prosesi buzda edilmeli.

Mysal goşanyňyzdan soň, aç-açan möhürleýji plyonkany goýuň.Aç-açan möhürleýji filmiň ýüzüne eliňiz bilen degmezlige synanyşyň, filmiň iki gapdalyndaky boşlukdan hereket ediň.Sebäbi barmak yzlary floresan signallaryň ýygnalmagyna täsir edip biler.Soňra nusganyň diwara asylmagynyň öňüni almak üçin pes tizlikde 10 s tizlik bilen sentrifugany ulanyň.

Degişli önümler:

Öýjük göni RT-qPCR toplumy

RT aňsat II