RT-qPCR molekulýar biologiýanyň esasy synagydyr we her kim munuň bilen tanyş bolmaly.Esasan üç basgançagy öz içine alýar: RNK çykarmak, CDNA tersine transkripsiýa we real wagt floresan mukdar PCR.Bu kömek edenok, näme bolýar?Mesele bar bolsa gerekters transkripsiýa synagy!Tersine transkripsiýa synagynda diňe RNK, dNTP, primer weters transkriptazsentrifuga turbasyna gowy garmaly, ýöne hakyky iş prosesinde henizem üns berilmeli köp jikme-jiklik bar.Geliň, bu hakda öwreneliň!

RNK-nyň hiline nädip baha bermeli?
CDNA almak üçin RNK-nyň hili möhümdir!RNK hilini esasan iki tarapdan kesgitläp bolýar:
(1) RNK bütewiligi:RNK bitewiligini agarose gel elektroforezi bilen barlap bolýar. Eukariotlary mysal hökmünde alsak, jemi RNK-nyň üç sany açyk zolagy bar, ululykdan kiçä molekulýar agramlary 28S, 18S we 5S, 28S bolsa 18S-den iki esse ýagty;üç zolagy görüp bolýan bolsa, ýöne toparyň görnüşi bulaşyk ýa-da Diffuziýa RNK-nyň bölekleýin zaýalanandygyny aňladýar.Bu wagt ters transkripsiýa reaksiýasyny derrew ýerine ýetiriň we şablon girişini ýerlikli köpeltmegiňizi haýyş edýäris;diňe kiçijik molekulýar agramly ýa-da hiç hili zolak görüp bolmaýan bolsa, RNK düýbünden zaýalanýar we gaýtadan çykarmaly.Agilent 2100, iň ýokary diagramma we RIN bahasy bilen RNK-nyň bitewiligini görkezýär.Nuklein kislotasy bitewi bolsa, elektroferogramyň esasy tekiz;nuklein kislotasy düýpli zaýalanan bolsa, esasy deň däl we has köp degradasiýa pikleri peýda bolýar;RIN-iň bahasy, RNK-nyň bitewiligini görkezýär, 0-10 aralygynda, bahasy näçe uly bolsa, RNK-nyň hili şonça gowy.Dogrylyk derejesi näçe ýokary bolsa.
(2) RNK-nyň arassalygy:OD260 / 280 gatnaşygy UV spektrofotometri arkaly kesgitläp bolýar.OD260 / 280 gatnaşygy 1,9 bilen 2.1 aralygynda bolsa, arassalygy gaty gowy.
Galyndy genom DNK nädogry mukdar netijelerine sebäp bolup biler
RNK çykarylanda, alnan RNK arassalanmadyk genom DNK (gDNA) bilen garylyp bilner.Şonuň üçin ters transkripsiýadan soň cDNA hem garylargDNA.Aşak akym wagtyndaqPCRreaksiýa,cDNAwe gDNA bir wagtyň özünde güýçlendirilip, KT bahasy az bolup biler, şonuň üçin netijeler ikitaraplaýyn bolup biler.
Bu ýagdaýda näme etmeli?Foregeneteklip edýär:
(1) Tersine RNK-da genleri arassalamak, RNK çykarmak wagtynda sütün çykarmak arkaly aýrylyp bilner;
(2) Çykarylan RNK-ny DNase bilen bejeriňI , ýöne EDTA bilen ýatyryň;
ters transkripsiýa reagentlerigenleri arassalamak modullary bilen;

Tersine transkripsiýa üçin primerleri nädip saýlamaly?
Ters transkripsiýa primerleri ters transkripsiýa reaksiýasynyň netijesine hem täsir edýär.Synagyň aýratyn ýagdaýlaryna görä ters transkripsiýa üçin tötänleýin primerleri, Oligo dT ýa-da genlere mahsus primerleri saýlap bilersiňiz:
(1) transörite ýazgylar: genlere mahsus primerler maslahat berilýär;
(2) Uzyn bölek ýazgylary: Oligo dT / gen aýratyn primerler maslahat berilýär;
(3) Uzyn segmentli ýazgylaryň içki bölekleri: genlere mahsus primerler / tötänleýin primerler / tötänleýin primerler + Oligo dT.Ondan soňky qPCR synag geçirilse, Oligo dT-ni ýeke özi ulanyp bolmaýar, sebäbi diňe Oligo dT-ni ulanmak 3 ′ ahyrky tarapyň döremegine sebäp bolup biler, bu bolsa nädogry qPCR synag netijelerine sebäp bolup biler;
(4) miRNA: Düwürtükli primerler ýa-da guýruk desgalary ulanylyp bilner.

Tersine transkripsiýa önümi cDNA mukdary üçin näçe gezek suwuklandyrylmaly?
Tersine transkripsiýa önüminiň cDNA-ny alandan soň, qPCR synaglary üçin cDNA-ny näçe gezek suwarmalydygy gaty möhümdir.CDNA konsentrasiýasy aşa ýokary ýa-da gaty pes bolsa, güýçlendirme netijeliligine täsir edip biler.CDNA konsentrasiýasyny ölçäp bolarmy we muny nädip etmeli?
.Bu wagt käbir dostlar diýerler, arassalanandan soň konsentrasiýany ölçerin;bu ýerde Foregene, CDNA-ny arassalamak maslahat berilmeýändigini ýatlatmak isleýär, sebäbi tersine alnan CDNA-nyň uzynlygy başga, arassalamakda gysga CDNA ýitýär.
(2) Onda näme etmeli?QPCR synagyndan öň, cDNA-nyň eritme gradiýentini deslapky synag arkaly kesgitläp bolýar.Mysal üçin: qPCR synaglary üçin şablon hökmünde cDNA aksiýa çözgüdi, 10 esse eritme we 100 esse eritme ulanyň we 18-28 aralygynda KT bahasy bolan eritme faktoryny saýlaň.

MiRNA-lary nädip tersine transkripsiýa etmeli?
miRNA, belok üçin kod bermeýän, takmynan 22 nt ululykdaky bir hatar kiçijik molekula RNK.Gysga uzynlygy sebäpli adaty qPCR usuly ony gönüden-göni kesgitlemek kyn, şonuň üçin köplenç miRNA-ny uzaltmak zerur;miRNA üçin köplenç ulanylýan ters transkripsiýa usullary, aýlaw usuly we guýruk usulyny öz içine alýar.
“Stem-loop” usuly, “stem-loop” primerlerini goşmak bilen miRNA-ny giňeltmekdir.Bu kesgitleme usuly has ýokary duýgurlyga we aýratynlyga eýedir, ýöne kesgitlemegiň geçirijiligi pesdir.Bir ters transkripsiýa diňe bir miRNA we içerki salgylanmany tapyp biler;guýruk goşmak usuly iki bölekden durýar PolyA polimeraza we ters transkriptaz bolan iki fermentiň bilelikdäki hereketi bilen tamamlanýar.PolyA polimeraza, uzynlygyny ýokarlandyrmak üçin miRNA-a PolyA guýruklaryny goşmak üçin jogapkär we ters transkriptaz ters transkripsiýa reaksiýasyny ýerine ýetirýär.Bu usul ýokary kesgitleýiş geçirijisine eýedir we bir ters transkripsiýada birnäçe miRNA-ny we içerki salgylanmalary kesgitläp biler, ýöne sapak usulynda duýgurlyk we aýratynlyk pes.