Real Time PCR, mukdar PCR ýa-da qPCR diýlip hem atlandyrylýar, PCR güýçlendiriji önümlerine real wagt gözegçilik we derňew usulydyr.
Mukdar PCR ýönekeý işlemegiň, çalt we amatly, ýokary duýgurlyk, gowy gaýtalanma we pes hapalanma derejesi ýaly artykmaçlyklara eýe bolany üçin, lukmançylyk synagynda, neşe serişdeleriniň netijeliligini bahalandyrmakda, gen aňlatma gözleginde, transgen gözleginde, geni kesgitlemekde, patogen tapmakda, haýwanlary we ösümlikleri kesgitlemekde giňden ulanylýar., iýmit synagy we beýleki ugurlar.
Şonuň üçin durmuş ylymlary boýunça esasy gözlegler bilen meşgullanýarsyňyzmy ýa-da derman öndürýän kompaniýalaryň, maldarçylyk kompaniýalarynyň, azyk kompaniýalarynyň, hatda giriş-barlag we karantin býurolarynyň, daşky gurşaw gözegçiligi bölümleriniň, hassahanalaryň we beýleki bölümleriň işgärleri bolsun, ýa-da mukdar PCR-ni özleşdirmek bilimini bilmelisiňiz.

Real Time PCR ýörelgesi

Real Time PCR, PCR reaksiýa ulgamyna floresan maddalaryň goşulýan usulydyr we PCR reaksiýasyndaky floresan signalyň intensiwligi mukdarda PCR guraly bilen hakyky wagtda gözegçilik edilýär we ahyrynda synag synaglary seljerilýär we işlenýär.

【Güýçlendirmek egrisi】PCR-iň dinamiki prosesini suratlandyrýan egridir.PCR-iň güýçlendirme egrisi aslynda adaty ekspensial egrilik däl, sigmoid egrisi.

[Güýçlendirmek egrisiniň platforma tapgyry]PCR siklleriniň sanynyň köpelmegi, DNK polimerazynyň hereketsiz galmagy, DNTP-leriň we primerleriň könelmegi we önümiň pirofosfat we ş.m. reaksiýasy bilen sintez reaksiýasynyň gadagan edilmegi bilen PCR hemişe çalt ösmeýär.we ahyrynda platosa girer.

[Güýçlendirmek egrisiniň ekspensial ösüş sebiti]Plato fazasy düýpgöter üýtgese-de, güýçlendirme egrisiniň ekspensial ösüş sebitiniň belli bir sebitinde gaýtalanma mümkinçiligi gaty gowy, bu PCR-iň mukdar taýdan derňewi üçin örän möhümdir.

[Bosaganyň bahasy we Ct bahasy]Floresan kesgitlemegiň çäkli bahasyny güýçlendiriji egriniň ekspensial ösüş meýdanynda, ýagny bosaganyň bahasyny (Bosag) kesgitledik.Bosgun bahasy bilen güýçlendiriji egriniň kesişmesi Ct bahasydyr, ýagny Ct bahasy, bosaganyň bahasyna ýetilende siklleriň sanyny (Threshold Cycle) aňladýar.

Aşakdaky grafikde bosaganyň çyzygy bilen güýçlendiriji egriniň, bosaganyň we Ct bahasynyň arasyndaky baglanyşyk aýdyň görkezilýär.

【Nädip baha bermeli?】

Matematiki teoriýa bilen Ct bahasynyň başlangyç şablonlaryň sanynyň logarifmi bilen ters çyzykly gatnaşygy barlygy subut edildi.Real Time PCR hakyky wagtda PCR güýçlendiriji önümlerine gözegçilik edýär we ekspensial güýçlendirme tapgyrynda baha berýär.

PCR-iň her sikli üçin DNK 2 esse artdy we tiz wagtdan platosa ýetdi.

Başlangyç DNK-nyň mukdary A diýip çaklasak₀ , n sikllerden soň, DNK önüminiň teoretiki mukdary:

A _n =A ₀ × 2ⁿ

Soň bolsa, başlangyç DNK mukdary näçe köp bolsa, güýçlendirilen önümiň mukdary An kesgitleme bahasyna näçe çalt ýeter we An-a ýetende siklleriň sany Ct bahasydyr.Aagny, başlangyç DNK mukdary A 0 näçe köp bolsa, güýçlendirme egrisi şonça ýokary bolýar we degişlilikde talap edilýän n siklleriň sany has az bolýar.

Belli konsentrasiýa standartynyň gradiýent süýşürilmegini amala aşyrýarys we ony Real Time PCR üçin şablon hökmünde ulanýarys we DNK mukdaryny az-azdan başlamak tertibi boýunça deň aralyklarda birneme güýçlendiriji egriler alynar.Ct bahasy bilen başlangyç şablonlaryň sanynyň logarifminiň arasyndaky çyzykly gatnaşyga görä, a[standart egrilik] döredilip bilner.

Nusganyň Ct bahasyny näbelli konsentrasiýa bilen adaty egrä çalyşmak bilen, hakyky wagt PCR-iň mukdar ýörelgesi bolan näbelli konsentrasiýa bilen nusganyň başlangyç şablon mukdaryny alyp bolýar.

Real Time PCR-ni kesgitlemek usuly

Real Time PCR reaksiýa ulgamyndaky floresan intensiwligini kesgitlemek arkaly PCR güýçlendiriji önümlerini kesgitleýär.

Floresan boýagy ornaşdyrmak usulynyň ýörelgesi】

Floresan boýaglarTB Green ® ýaly, PCR ulgamlarynda iki hatar DNK bilen baglanyşyk baglanandan soň floresan bilen aýratyn baglanyşyp biler.

Reaksiýa ulgamyndaky floresan intensiwligi PCR siklleriniň köpelmegi bilen çalt artdy.Floresan intensiwligini kesgitlemek bilen, reaksiýa ulgamyndaky DNK güýçlendiriş mukdaryny hakyky wagtda gözegçilik edip bolýar, soň bolsa nusgadaky başlangyç şablonyň mukdaryny tersine hasaplap bolýar.

【Floresan gözleg usulynyň ýörelgesi】

floresan zond5 ′ ujundaky floresan topary we 3 ′ ujundaky söndüriji topar bilen nuklein kislotasynyň yzygiderliligi, şablon bilen ýörite baglanyşyp biler.Synag üýtgemänsoň, florofordan çykýan floresan söndüriji topar tarapyndan söndürilýär we floresan bolup bilmeýär.Synag dargandan soň, floresan madda bölünip, floresan çykar.

PCR reaksiýa erginine floresan zond goşulýar.Düwürtme prosesinde floresan zond şablonyň belli bir ýerine bagly bolar.Giňeldiş prosesinde, PCR fermentiniň 5 ′ → 3 ′ ekzonukleýasiýa işjeňligi şablon bilen gibridlenen floresan zondy dargap biler we floresan madda floresan çykarmak üçin bölünýär.Reaksiýa ulgamyndaky zondyň floresan intensiwligini kesgitlemek bilen, PCR önüminiň güýçlendirme mukdaryna gözegçilik etmek maksadyna ýetip bolýar.

【Floresan kesgitlemegiň usulyny saýlamak】

Highokary gomologiýa bilen yzygiderliligi tapawutlandyrmak we SNP ýazuw derňewi ýaly multiplex PCR kesgitlemesini ýerine ýetirmek üçin ulanylsa, floresan gözleg usuly çalşyp bolmaýar.
Beýleki Real Time PCR synaglary üçin ýönekeý, aňsat we arzan bahaly floresan kimera usuly ulanylyp bilner.

probesStlex aýratynlygy, multiplex PCR-e ukyply

.Etmezçilik

Güýçlendirmek üçin ýokary aýratynlyk talaplary;

multiplex PCR ýerine ýetirip bolmaýar specificörite zondlary dizaýn etmek, ýokary çykdajy;

käwagt gözleg dizaýny kyn bolýar

Degişli önümler: