Esasy dizaýn esaslary (99% meseläni çözüp bolýar)
1. Esasy uzynlyk: Okuw kitaby 15-30bp, adatça 20bp talap edýär.Asyl ýagdaýy aýratynlygy üpjün etmek üçin 18-24bp bolmak has gowudyr, ýöne näçe gowy bolsa, şonça-da uzyn primer hem aýratynlygy azaldar we hasyllylygy azaldar.
2. Esasy güýçlendirme aralygy: 200-500bp ýerliklidir we bölegi belli şertlerde 10kb-a çenli giňeldip bolar.
3. Esasy esas: G + C-iň düzümi 40-60% bolmaly, gaty az G + C güýçlendiriji effekti gowy däl, G + C aýratyn däl zolaklarda görünmek aňsat.ATGC 5-den gowrak purin ýa-da pirimidin nukleotidleriniň toparlaryndan gaça durup, tötänleýin paýlanýar.Durnuklylygy ýokarlandyrmak, 3 ′ ujunda baý GC-den gaça durmak, soňky 3 bazada GC ýok ýa-da soňky 5 bazanyň 3-si üçin GC ýok 5 ′ ahyrky we aralyk yzygiderlilik üçin köp gc.
4. Astarlarda ikinji derejeli gurluşdan gaça duruň we iki primeriň arasynda biri-biriniň üstüni ýetirmekden gaça duruň, esasanam 3 'ahyrynda doldurgyç, ýogsam primer dimer emele geler we ýörite däl güýçlendirilen zolaklar dörediler.
5. Astarlaryň 3 'ujundaky esaslar, esasanam iň soňky we ahyrky esaslar, birleşdirilmedik terminal bazalary sebäpli PCR şowsuzlygynyň öňüni almak üçin berk jübütlenmeli.
6. Primerlere degişli ýyrtylýan ýerler bar ýa-da goşup bolýar, güýçlendirilen maksat yzygiderliliginde ýer bölekleriniň derňewi ýa-da molekulýar klonlaşdyrylmagy üçin örän peýdaly ýer bölekleri bolmaly.
7. Astarlaryň aýratynlygy: primerlerde nuklein kislotasynyň yzygiderliligi maglumatlar bazasyndaky beýleki yzygiderlilikler bilen aç-açan gomologiýa bolmaly däldir.
8. Programma üpjünçiligini ulanmagy öwreniň: PP5, Oligo6, DNAstar, Vektor NTI, primer3 (Bu onlaýn dizaýn iň oňat işleýär).
Aboveokardaky mazmun, deslapky dizaýn meseleleriniň azyndan 99% -ini çözüp biler.
Astar dizaýnynyň jikme-jikliklerine gözegçilik ediň
1. Esasy uzynlyk
Umumy desganyň uzynlygy 18 ~ 30 esasdyr.Umuman aýdanyňda, primeriň gyzdyryjy temperaturasyny kesgitleýän iň möhüm faktor, asmanyň uzynlygydyr.Astaryň gyzdyryjy temperaturasy köplenç saýlanýar (Tm bahasy -5 ℃), käbirleri gönüden-göni Tm bahasyny ulanýarlar.Astarlaryň gyzdyryjy temperaturasyny takmynan hasaplamak üçin aşakdaky formulalar ulanylyp bilner.
Astaryň uzynlygy 20bp-den pes bolanda: [4 (G + C) +2 (A + T)] - 5 ℃
Astaryň uzynlygy 20bp-den uly bolsa: 62.3 ℃ + 0.41 ℃ (% GC) -500 / uzynlyk-5 ℃
Mundan başga-da, ýanýan temperaturany hasaplamak üçin köp programma üpjünçiligi hem ulanylyp bilner, hasaplama ýörelgesi başgaça bolar, şonuň üçin käwagt hasaplanan bahada azajyk boşluk bolup biler.PCR reaksiýalaryny optimizirlemek üçin, iň pes netijelilik we aýratynlyk üçin 54 less-dan pes bolmadyk temperaturany üpjün edýän iň gysga primerler ulanylýar.
Umuman aýdanyňda, deslapky aýratynlyk her goşmaça nukleotid üçin dört faktor bilen ýokarlanýar, şonuň üçin amaly programmalaryň iň az uzynlygy 18 nukleotid bolýar.Astaryň uzynlygynyň ýokarky çägi gaty möhüm däl, esasan reaksiýanyň netijeliligi bilen baglanyşykly.Entropiýa sebäpli, primer näçe uzyn bolsa, DNK polimerazynyň birleşdirilmegi üçin durnukly iki hatar şablon emele getirmek üçin maksat DNK-a baglanmak tizligi şonça pes bolar.
Astarlary dizaýn etmek üçin programma üpjünçiligi ulanylanda, primerleriň uzynlygy öz gezeginde TM bahasy bilen kesgitlenip bilner, esasanam floresan mukdar PCR başlangyçlary üçin TM = 60 ℃ ýa-da şonuň üçin gözegçilik edilmelidir.
2.GC mazmuny
Adatça, başlangyç yzygiderlilikde G + C-iň mazmuny 40% ~ 60%, bir jübüt primeriň GC mazmuny we Tm bahasy utgaşdyrylmalydyr.Astarda çynlakaý GC ýa-da AT meýli bar bolsa, primeriň 5 'ujuna degişli mukdarda A, T ýa-da G we C guýrugy goşup bolýar.
3. Annealing temperaturasy
Düwürtme temperaturasy zynjyrdan 5 ℃ pes bolmaly.Esasy bazalaryň sany az bolsa, PCR-iň aýratynlygyny ýokarlandyryp bilýän, gyzdyryjy temperatura degişli derejede ýokarlanyp bilner.Bazalaryň sany köp bolsa, gyzdyryjy temperatura degişli derejede peseldilip bilner.4 ℃ ~ 6 prim jübütleriň arasyndaky gyzdyryjy temperatura tapawudy PCR hasylyna täsir etmez, ýöne iň gowusy, bir jübüt primeriň gyzdyryjy temperaturasy 55 ℃ ~ 75 between arasynda üýtgäp bilýän birmeňzeşdir.
4. Güýçlendirme şablonynyň ikinji derejeli gurluş meýdanyndan gaça duruň
Güýçlendirilen bölegi saýlanyňyzda şablonyň ikinji derejeli gurluş sebitinden gaça durmak iň gowusydyr.Maksat bölekiniň durnukly ikinji derejeli gurluşy, şablon saýlamak üçin peýdaly bolan degişli kompýuter programma üpjünçiligi tarapyndan çak edilip we bahalandyrylyp bilner.Synag netijeleri, giňeldilmeli sebitiň erkin energiýasy (△ G) 58,6lkJ / mol-dan az bolanda giňeltmegiň köplenç şowsuz bolýandygyny görkezýär.
5. Maksatly DNK bilen gabat gelmezlik
Güýçlendirilen maksatly DNK yzygiderliligi uly bolanda, deslapky maksat DNK-nyň birnäçe bölegi bilen baglanyşyp biler, netijede birnäçe zolak peýda bolar.Bu gezek BLAST programma üpjünçiligini synagdan geçirmek, web sahypasy:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Iki yzygiderliligi deňlemek (bl2seq) saýlaň.
Esasy yzygiderliligi 1-nji zona we maksatly DNK yzygiderliligini 2-nji zona çalyşmak çalşylýar we BLAST biri-biriniň üstüni ýetirýän, antisense we beýleki mümkinçilikleri hasaplaýar, şonuň üçin ulanyjylar iki zynjyryň hem duýgy zynjyrydygyna üns bermeli däldirler.Şeýle hem maglumatlar bazasyndaky yzygiderliligiň GI belgisini bilýän bolsaňyz, GI belgisini girizip bilersiňiz, şonuň üçin yzygiderliligiň uly bölegini goýmaly dälsiňiz.Ahyrynda, maksatly DNK-da birmeňzeş birmeňzeş saýtlaryň bardygyny ýa-da ýokdugyny görmek üçin 3-de deňleşdirmek düwmesine basyň.
6. Esasy terminal
Astaryň 3 'ujy, uzalmanyň başlanýan ýeri, şonuň üçin şol ýerden başlamazlyklaryň öňüni almak möhümdir.3 'soňy yzygiderli 3 G ýa-da C-den köp bolmaly däldir, sebäbi bu primeriň G + C baýlaşdyryş yzygiderliligi sebitinde ýalňyşlyk bilen ýüze çykmagyna sebäp bolar.3 'ujy, ýörite PCR (AS-PCR) reaksiýalaryndan başga hiç hili ikinji derejeli gurluşy emele getirip bilmez, primeriň 3 ′ ujy gabat gelmez.Mysal üçin, kodlaýyş sebiti güýçlendirilen bolsa, koduň üçünji pozisiýasynda 3 'primer gutarmaly däldir, sebäbi kodonyň üçünji pozisiýasy ýaramazlaşmaga ýykgyn edýär, bu güýçlendirmegiň aýratynlygyna we netijeliligine täsir eder.Anneksiýa desgalaryny ulananyňyzda kodon ulanylyş tablisasyna serediň, biologiki ileri tutmalara üns beriň, 3 ′ ujunda anneksiýa primerlerini ulanmaň we has ýokary konsentrasiýalary ulanyň (1uM-3uM).
7. Astarlaryň ikinji derejeli gurluşy
Astarlaryň özlerinde goşmaça yzygiderlilikler bolmaly däldir, ýogsam primerleriň özleri saç çyzgylaryna öwrüler we bu ikinji derejeli gurluş, steriki päsgelçilik sebäpli primerleriň we şablonlaryň baglanyşygyna täsir eder.Emeli höküm ulanylsa, primerleriň üznüksiz goşmaça esaslary 3bp-den köp bolmaly däldir.Iki desganyň arasynda biri-biriniň üstüni ýetirmeli däldir, esasanam başlangyç ölçegleriň emele gelmeginiň öňüni almak üçin 3 'ujunyň üst-üstündäki biri-biriniň üstüni doldurmaly.Umuman aýdanyňda, bir jübüt primeriň arasynda yzygiderli 4 esasdan gomologiýa ýa-da biri-biriniň üstüni ýetirýän bolmaly däldir.
8. Markerler ýa-da loki goşuň
5 'soňy güýçlendirme aýratynlygyna az täsir edýär we şonuň üçin güýçlendirme aýratynlygyna täsir etmezden üýtgedilip bilner.Primer 5 'ujuny üýtgetmek aşakdakylary öz içine alýar: fermentleriň çäklendirilen ýerini goşmak;Bellikli biotin, floresan, digoksin, Eu3 + we ş.m. bellikli DNK yzygiderliligini belok bilen tanyşdyryň;Mutasiýa saýtlaryny tanatmak, mutasiýa yzygiderliligini girizmek we ýitirmek we öňe süriji yzygiderliligi girizmek we ş.m. Goşmaça esaslar güýçlendirmegiň netijeliligine täsir eder we başlangyç ölçegleriň döremek mümkinçiligini artdyrar, ýöne indiki ädim üçin käbir eglişikler edilmelidir.Çäklendiriji saýtlar we mahabatlandyryjy yzygiderlilikler ýaly maksat yzygiderliliginde ýok bolan goşmaça yzygiderliligi, primeriň 5 ′ ujuna aýratynlyga täsir etmezden goşup bolýar.Bu yzygiderlilik başlangyç Tm bahalaryny hasaplamaga goşulmaýar, ýöne biri-biriniň üstüni ýetirmek we içerki ikinji derejeli gurluş üçin synag edilmeli.
9. Subclones
Köplenç PCR diňe deslapky klonlaşdyrma bolup durýar, soň bolsa maksat bölegini dürli wektorlara bölmeli, şonuň üçin PCR ädiminde indiki amal üçin goşmaça esaslary düzmeli.
Bölünmek üçin döredilen käbir yzygiderlilik aşakda jemlenendir.
Çäklendiriji endonukleýz çäklendirme sahypasy goşuldy
Ferment çäklendiriji saýtlary goşmak, PCR önümlerini bölmek üçin iň köp ulanylýan usul.Adatça, ýarylýan ýer alty esas bolup, ýaryş meýdançasynyň 5 'ujundan başga-da 2 ~ 3 gorag bazasy goşmaly.Şeýle-de bolsa, dürli fermentler tarapyndan talap edilýän gorag bazalarynyň sany başga.Mysal üçin, SalⅠ gorag bazasyny talap etmeýär, EcoRⅤ 1 gorag bazasyny, NotⅠ 2 gorag bazasyny, Hind 3 3 gorag bazasyny talap edýär.
LIC guýrugy goşýar
LIC-iň doly ady “Ligation-Independent klonlaşdyryş”, Navogen tarapyndan PET wektorynyň bir bölegi üçin ýörite oýlap tapylan klonlaşdyryş usulydyr.LIC usuly bilen taýýarlanan PET daşaýjy, goşmaça däl 12-15 esasy ýeke çyzykly ýelmeşýän uçlara eýe bolup, maksat goýulýan bölekde degişli ýelmeşýän uçlary doldurýar.Güýçlendirmek maksady bilen, goýlan bölekleriň başlangyç 5 ′ yzygiderliligi LIC wektoryny doldurmalydyr.T4 DNK polimerazynyň 3 ′ → 5 ′ ekstrakt işjeňligi, gysga wagtdan soň goýlan bölekde bir çyzykly ýelmeşip bilýär.Önüm diňe taýýarlanan bölek we wektoryň özara baglanyşygyndan emele gelip bilýändigi sebäpli, bu usul gaty çalt we täsirli we klonirlemäge gönükdirilendir.
Ectedolbaşçy TA klony guýruk goşýar
TA klonirlemesi bölegi wektora gönükdirip bilmedi, şonuň üçin Invitrogen bir ujunda dört sany esasy GTGGS bolan klonirlemegi nyşana alyp bilýän wektor hödürledi.Şonuň üçin PCR primerleriniň dizaýnynda bölekler “ugrukdyrylyp” bolar ýaly goşmaça yzygiderlilikler goşulmalydyr.
Wagtynda gysga bolsaňyz, geni wektor bilen birleşdirip, göni sintez edip bilersiňiz, bu bolsa muskulistlerde ET gen sintezi diýýäris.
D. In-Fusion klonlaşdyryş usuly
Hiç hili baglanyşyk gerek däl, uzak reaksiýa gerek däl.Çyzykly wektoryň iki ujunda yzygiderlilik girizilse, primerleriň dizaýnynda PCR önümi we çyzykly wektor BSA-ny öz içine alýan ferment erginine goşulyp, ýarym sagat otag temperaturasynda ýerleşdirilse, öwrülişik amala aşyrylyp bilner.Bu usul uly göwrümli öwrülişik üçin aýratyn amatlydyr.
10. Asteri birleşdiriň
Käwagt, deslapky dizaýn hakda diňe çäkli yzygiderlilik maglumatlary belli.Mysal üçin, diňe aminokislotanyň yzygiderliligi belli bolsa, birleşdiriji primer dizaýn edilip bilner.Birleşmek primeri, bir aminokislotany kodlaýan dürli esasy mümkinçilikleri görkezýän dürli yzygiderliligiň garyndysydyr.Aýratynlygy ýokarlandyrmak üçin, dürli organizmleriň esasy ulanyş isleglerine görä anneksiýany azaltmak üçin kodon ulanylyş tablisasyna ýüz tutup bilersiňiz.Gipoksantin, primeriň gyzdyryjy temperaturasyny peseltmek üçin ähli esaslar bilen jübütlenip bilner.Astaryň 3 ′ ujundaky goşundy esaslary ulanmaň, sebäbi 3 ′ ujundaky soňky 3 bazanyň birikdirilmegi nädogry ýerde PCR açmak üçin ýeterlikdir.Has ýokary konsentrasiýalar (1μM-den 3μM) ulanylýar, sebäbi köp sanly anneksiýa garyndylaryndaky primerler maksat şablonyna mahsus däl.
PCR çig malgözegçilik
1. Esasy mukdar
Her primeriň konsentrasiýasy 0,1 ~ 1umol ýa-da 10 ~ 100pmol.Iň az mukdarda primer bilen zerur netijäni bermek has gowudyr.Astaryň ýokary konsentrasiýasy gabat gelmezlige we aýratyn däl güýçlendirilmegine sebäp bolar we primerleriň arasynda ölçeg emele getirmek mümkinçiligini artdyrar.
2. Esasy konsentrasiýa
Astarlaryň konsentrasiýasy aýratynlyga täsir edýär.Iň amatly başlangyç konsentrasiýasy, adatça, 0,1 bilen 0,5μM aralygyndadyr.Primokarky primer konsentrasiýalary belli bolmadyk önümleriň güýçlenmegine getirýär.
3. Astaryň gyzdyryjy temperaturasy
Astarlar üçin başga bir möhüm parametr, ereýän temperatura (Tm).Astarlaryň we goşmaça yzygiderliligiň 50% -i iki hatar DNK molekulalary hökmünde görkezilende temperatura.Tm PCR annealing temperaturasyny bellemek üçin talap edilýär.Iň gowusy, deslapky yzygiderliligi maksatly yzygiderliligi üpjün etmek üçin ýeterlik derejede pes, ýöne belli bir baglanyşygy azaltmak üçin ýeterlik derejede ýokary.55 ℃ 70 from aralygynda göwnejaý gyzdyryjy temperatura.Annealing temperaturasy, adatça, Tm primerden 5 ℃ pes bolýar.
Tm-ni sazlamagyň birnäçe formulasy bar, ulanylýan formula we primerleriň yzygiderliligine baglylykda gaty üýtgeýär.Formulalaryň köpüsi takmynan Tm bahasyny üpjün edýändigi sebäpli, ähli gyzdyryjy temperaturalar diňe başlangyç nokatdyr.Aýratynlyk, gyzgynlygyň temperaturasyny kem-kemden ýokarlandyrýan birnäçe reaksiýany seljermek arkaly gowulaşyp biler.Takmynan Tm-5 below-dan aşakda başlaň we 2 an ýokarlandyryşda ýuwaş-ýuwaşdan gyzgynlygy ýokarlandyryň.Anokary gyzgynlyk temperaturasy başlangyç ölçegleriň we aýratyn däl önümleriň emele gelmegini azaldar.Iň oňat netijeler üçin iki primeriň takmynan Tm bahalary bolmaly.Astar jübütleriň Tm tapawudy 5 more-dan köp bolsa, desgalar aýlawda has pes ýylylyk temperaturasyny ulanyp, düýpli ýalňyş başlangyjy görkezer.Iki başlangyç Tm tapawutly bolsa, iň pes Tm-den 5 ℃ pes derejä belläň.Ativea-da bolmasa, aýratynlygy ýokarlandyrmak üçin ilki bilen has ýokary Tm üçin niýetlenen anneal temperaturada bäş sikl ýerine ýetirilip bilner, galan sikller bolsa pes Tm üçin döredilen temperaturada.Bu, niýetlenen şablonyň bölekleýin göçürmesini berk şertlerde almaga mümkinçilik berýär.
4. Esasy arassalyk we durnuklylyk
Customörite desgalaryň adaty arassalygy PCR programmalarynyň köpüsi üçin ýeterlikdir.Benzoýl we izobutil toparlaryny süýjediji bilen aýyrmak az bolýar we şonuň üçin PCR-e päsgel bermeýär.Käbir programmalar sintez prosesinde doly däl yzygiderliligi aýyrmak üçin arassalanmagy talap edýär.Bu kesilen yzygiderlilik, DNK sintez himiýasynyň netijeliligi 100% bolmanlygy sebäpli ýüze çykýar.DNK 3 ′ 5 ′ aralygynda DNK ýasamak üçin her bir himiki reaksiýany ulanýan tegelek proses.Iki aýlawda-da şowsuz bolup bilersiňiz.Uzyn primerler, esasanam 50 bazadan uly bolanlar, kesilen yzygiderliligiň uly bölegine eýedir we arassalanmagy talap edip biler.
Astarlaryň hasyllylygy sintetiki himiýanyň we arassalama usulynyň täsirine täsir edýär.Sitologiýa we Şengong ýaly biofarmasewtika kompaniýalary, oligonukleozidiň umumy önümçiligini üpjün etmek üçin iň az OD bölümini ulanýarlar.Primörite desgalar gury poroşok görnüşinde iberilýär.Iň soňky konsentrasiýasy 100μM bolar ýaly, TE-de primerleri gaýtadan eritmek iň gowusydyr.TE deionizirlenen suwdan has gowudyr, sebäbi suwuň pH köplenç kislotaly bolup, oligonukleozidleriň gidrolizine sebäp bolar.
Astarlaryň durnuklylygy saklanyş şertlerine baglydyr.Gury poroşok we erän primerler -20 at derejesinde saklanmalydyr.TE-de 10μM-den uly konsentrasiýalarda erän primerler -20 at-da 6 aý durnukly saklanyp bilner, ýöne otag temperaturasynda (15 ℃ 30 ℃) 1 hepdeden az saklanyp bilner.Gury poroşok primerleri azyndan 1 ýyl -20 C, otag temperaturasynda (15 C-den 30 C) 2 aýa çenli saklanyp bilner.
5. Fermentler we olaryň konsentrasiýalary
Häzirki wagtda ulanylýan Taq DNK polimerazy, esasan, koliforma bakteriýalary bilen sintezlenýän gen in engineeringener fermentidir.Adaty PCR reaksiýasyny katalizlemek üçin zerur fermentiň mukdary takmynan 2,5U (100ul reaksiýanyň umumy göwrümine degişlidir).Eger konsentrasiýa gaty ýokary bolsa, belli bolmadyk güýçlendirilmegine sebäp bolup biler;konsentrasiýasy gaty pes bolsa, sintetiki önümiň mukdary azalar.
6. DNTP-iň hili we konsentrasiýasy
DNTP-iň hili konsentrasiýa we PCR güýçlendirmegiň netijeliligi bilen ýakyndan baglanyşyklydyr.DNTP poroşok granuladyr, üýtgewsizligi nädogry saklansa biologiki işjeňligini ýitirýär.dNTP ergini kislotaly we ýokary konsentrasiýada ulanylmaly, 1M NaOH ýa-da 1M Tris.HCL bufer ergini, PH-ni 7.0 ~ 7.5, az mukdarda gaplama, doňdurylan ammar -20 at.Birnäçe doňdurma eriş dNTP-ni peselder.PCR reaksiýasynda dNTP 50 ~ 200umol / L bolmaly.Esasanam dört DNTPS konsentrasiýasyna deň bolmaly (deň mukdarda taýynlyk).Olaryň haýsydyr biriniň konsentrasiýasy beýlekilerden tapawutly bolsa (ýokary ýa-da aşaky), gabat gelmezlige sebäp bolar.Örän pes konsentrasiýa PCR önümleriniň hasyllylygyny peselder.dNTP Mg2 + bilen birleşip, mugt Mg2 + konsentrasiýasyny azaldyp biler.
7. Şablon (maksatly gen) nuklein kislotasy
Şablon nuklein kislotasynyň mukdary we arassalaýyş derejesi PCR-iň üstünligi ýa-da şowsuzlygy üçin esasy baglanyşyklardan biridir.Adaty DNK arassalaýyş usullary, nusgalary siňdirmek we ýok etmek üçin adatça SDS we K proteaz ulanýar.SDS-iň esasy wezipeleri şulardan ybarat: öýjük membranasyndaky lipidleri we beloklary eritmek, şeýlelik bilen membranaly beloklary eritmek arkaly öýjük membranasyny ýok etmek we öýjükdäki ýadro beloklaryny bölmek, SDS beloklar bilen birleşip we çökdürip biler;Proteaz K beloklary, esasanam DNK bilen baglanyşykly gistonlary gidrolizläp we siňdirip biler, soňra beloklary we beýleki öýjük böleklerini çykarmak üçin organiki çözüji fenol we hloroform ulanyp, nuklein kislotasyny çökdürmek üçin etanol ýa-da izopropil spirtini ulanyp biler.Çykarylan nuklein kislotasy PCR reaksiýalary üçin şablon hökmünde ulanylyp bilner.Umumy kliniki kesgitleme nusgalary üçin öýjükleri eritmek, patogenleri lizat etmek, hromosomalardan beloklary siňdirmek we erkin maksatly genlere çykarmak we PCR güýçlendirmek üçin gönüden-göni ulanylýan çalt we ýönekeý usul ulanylyp bilner.RNK şablonyny çykarmak, RNase RNK-nyň zaýalanmagynyň öňüni almak üçin adatça guanidin izotiosýanat ýa-da proteaz K usulyny ulanýar.
8.Mg2 + konsentrasiýa
Mg2 + PCR güýçlendirmek aýratynlygyna we hasyllylygyna ep-esli täsir edýär.Umuman PCR reaksiýasynda, dürli dNTP konsentrasiýasy 200umol / L bolanda, Mg2 + -niň degişli konsentrasiýasy 1,5 ~ 2.0mmol / L.Mg2 + konsentrasiýasy gaty ýokary, reaksiýanyň aýratynlygy peselýär, aýratyn güýçlendirme ýüze çykýar, aşa pes konsentrasiýa Taq DNK polimerazynyň işjeňligini azaldar, netijede reaksiýa önümleriniň azalmagyna getirer.
Magniý ionlary PCR-iň hasyllylygyna täsir edýän DNK polimeraza işjeňligi ýaly birnäçe tarapyna täsir edýär;Başga bir mysal, aýratynlyga täsir edýän primer annealing.dNTP we şablon, ferment işjeňligi üçin zerur bolan magnezium ionynyň mukdaryny azaldyp, magniý ionyna baglydyr.Iň amatly magniý ion konsentrasiýasy dürli başlangyç jübütler we şablonlar üçin üýtgeýär, ýöne 200μM dNTP bilen adaty PCR başlangyç konsentrasiýasy 1,5mM (bellik: Hakyky mukdarda PCR üçin, floresan zond bilen 3-5 mM magniý ion erginini ulanyň).Erkin magniý ionlarynyň ýokary konsentrasiýasy hasyllylygy ýokarlandyrýar, şeýle hem belli bolmadyk güýçlendirmäni ýokarlandyrýar we wepalylygy peseldýär.Iň amatly konsentrasiýany kesgitlemek üçin, magniý ion titrleri 1mM-den 3mM-a çenli 0,5mM aralykda ýerine ýetirildi.Magniý ionynyň optimizasiýasyna garaşlylygy azaltmak üçin Platinum Taq DNK polimerazy ulanylyp bilner.Platinum Taq DNK polimerazasy, Taq DNK polimeraza garanyňda magneziý ion konsentrasiýalarynyň has giň diapazonynda işlemäge ukyply we şonuň üçin az optimizasiýa talap edýär.
9. Pcr-öňe sürýän goşundylar
Şablonlaryň köpüsiniň ýokary derejede güýçlendirilmegi üçin gyzdyryjy temperaturany, deslapky dizaýny we magniý ion konsentrasiýasyny optimizirlemek ýeterlikdir;şeýle-de bolsa, GC mazmuny ýokary bolan käbir şablonlar goşmaça çäreleri talap edýär.DNK-nyň ereýän temperaturasyna täsir edýän goşundylar önümiň aýratynlygyny we hasyllylygyny ýokarlandyrmagyň başga bir usuly bilen üpjün edýär.Iň gowy netijeler üçin şablonyň doly denaturasiýasy zerurdyr.
Mundan başga-da, ikinji derejeli gurluş deslapky baglanyşygyň we fermentiň uzalmagynyň öňüni alýar.
Formamid, DMSO, gliserin, betaine we PCRx Enhancer Solution ýaly PCR goşundylary güýçlendirmäni güýçlendirýär.Mümkin bolan mehanizm, ereýän temperaturany peseltmek, şeýlelik bilen primerleriň ýakylmagyna we ikinji derejeli gurluş sebiti arkaly DNK polimeraza giňelmegine kömek etmekdir.PCRx Solution-yň başga artykmaçlyklary bar.Platinum Taq DNK polimeraza we Platinum Pfx DNK polimeraza bilen ulanylanda minimal magniý ion optimizasiýasy zerurdyr.Şeýlelik bilen, platina usuly, magnezium ion optimizasiýasynyň üçünji çemeleşmesine garaşlylygy azaltmak bilen, aýratynlygy ýokarlandyrmak üçin goşundy bilen birleşdirilýär.Iň oňat netijeler üçin goşundylaryň konsentrasiýasy optimallaşdyrylmaly, esasanam Taq DNK polimerazyny saklaýan DMSO, formamid we gliserol.
10. Gyzgyn başlangyç
“Hot start PCR” gowy başlangyç dizaýnyna goşmaça PCR aýratynlygyny ýokarlandyrmagyň iň möhüm usullaryndan biridir.Taq DNK polimerazynyň iň amatly uzalma temperaturasy 72 bolsa-da, polimeraza otag temperaturasynda işjeň bolýar.Şeýlelik bilen, PCR reaksiýasy taýýarlanylanda we ýylylyk sikliniň başynda saklaýyş temperaturasy gyzdyryjy temperaturadan pes bolanda öndürilýär.Döredilenden soň, bu belli bolmadyk önümler netijeli güýçlendirilýär.Esasy dizaýn üçin ulanylýan saýtlar, sahypa gönükdirilen mutasiýa, aňlatma klonlaşdyrylmagy ýa-da DNK in engineeringenerçiligi üçin ulanylýan genetiki elementleriň gurluşy we manipulýasiýasy ýaly genetiki elementleriň ýerleşişi bilen çäklendirilende has täsirli PCR has täsirli bolýar.
Taq DNK polimerazynyň işjeňligini çäklendirmegiň umumy usuly, buzda PCR reaksiýa erginini taýýarlamak we gyzdyrylan PCR enjamyna ýerleşdirmekdir.Bu usul ýönekeý we arzan, ýöne fermentiň işjeňligini tamamlamaýar we şonuň üçin aýratyn däl önümleriň güýçlendirilmegini düýbünden ýok etmeýär.
Malylylyk desgasy, PCR enjamy denaturasiýa temperaturasyna ýetýänçä möhüm komponenti saklap, DNK sintezini gijikdirýär.Taq DNK polimerazynyň gijikdirilen goşulmagyny goşmak bilen el bilen termiki başlangyç usullarynyň köpüsi, esasanam ýokary geçiş programmalary üçin kyn.Malylylyk başlangyç usullary, magniý ionlaryny ýa-da fermentleri goşmak bilen möhüm komponenti gurşap almak ýa-da şablonlar we buferler ýaly reaktiw komponentleri fiziki taýdan izolirlemek üçin mum galkanyny ulanýarlar.Malylylyk siklinde mumyň eremegi bilen dürli komponentler bölünip aýrylýar.El bilen gyzgyn başlangyç usuly ýaly, mumyň galkan usuly kyn we hapalanmaga meýilli we ýokary geçiş programmalary üçin amatly däl.
Platin DNK polimeraza awtomatiki gyzgyn PCR üçin amatly we täsirli.Platina Taq DNK polimerazasy, Taq DNK polimerazyna garşy monoklonal antikor bilen birleşdirilen rekombinant Taq DNK polimerazasyndan durýar.Antikorlar PCR tarapyndan uzak wagtlap temperatura saklanylanda ferment işjeňligini saklamak üçin düzülýär.Taq DNK polimeraza, denimatasiýa ädiminiň 94 ℃ izolýasiýasy wagtynda reaksiýa goýberildi we doly polimeraza işjeňligini dikeltdi.Malylylyk başlangyjy üçin himiki taýdan üýtgedilen Taq DNK polimerazasyndan tapawutlylykda, platina fermenti polimerazany işjeňleşdirmek üçin 94 ℃ (10-15 minut) uzak izolýasiýa talap etmeýär.“PlatinumTaq” DNK polimerazasy bilen, Taq DNK polimeraza işjeňliginiň 90% -i 94 at 2 minutdan soň dikeldildi.
11. Nest-PCR
Höwürtgelenen primerleri ulanyp yzygiderli güýçlendirmek, aýratynlygy we duýgurlygy ýokarlandyryp biler.Birinji tapgyr, 15-20 aýlawyň adaty güýçlendirilmegi.Başlangyç güýçlendiriji önümiň ujypsyzja bölegi 100-den 1000 gezek suwuklandyryldy we güýçlendirişiň ikinji tapgyryna 15-20 aýlaw goşuldy.Ativea-da bolmasa, ilkibaşdaky güýçlendirilen önüm jel arassalanmagy bilen ölçelip bilner.Birinji primeriň içindäki maksat yzygiderliligine baglanyp bilýän güýçlendirme ikinji tapgyrynda ýerleşdirilen primer ulanylýar.Höwürtgelenen PCR-iň ulanylmagy, birnäçe maksatly saýtlaryň güýçlendirilmegi mümkinçiligini azaldar, sebäbi iki deslapky toplumyň üstüni ýetirýän maksat yzygiderliligi az.Birmeňzeş primerler bilen birmeňzeş siklleriň sany (30-40), belli bolmadyk ýerleri güýçlendirdi.Öýlenen PCR çäkli maksat yzygiderliliginiň duýgurlygyny ýokarlandyrýar (meselem, seýrek mrnalar) we kyn PCRS (meselem 5 ′ RACE) aýratynlygyny ýokarlandyrýar.
12. Aşakdaky PCR
Aşakdaky PCR, PCR-iň ilkinji siklleri üçin berk anneal şertleri ulanyp, aýratynlygy ýokarlandyrýar.Sikl, takmynan Tm-den takmynan 5 ℃ ýokary temperaturada başlaýar, soňra her aýlaw 1 ℃ 2 is azalýar, anne temperaturasy Tm 5 below-dan pes bolýança.Diňe iň ýokary gomologiýa bolan maksat şablony güýçlendiriler.Bu önümler güýçlendirilen belli bolmadyk önümleri köpeldip, indiki sikllerde giňelmegini dowam etdirýärler.Aşakdaky PCR, AFLP DNK barmak yzy ýaly primer we maksat şablonynyň arasyndaky gomologiýa derejesi belli bolmadyk usullar üçin peýdalydyr.
Degişli PCR toplumlary
2 × PCR GahrymanyTMGaryşyk ulgamy, PCR inhibitorlaryna adaty PCR Mix ulgamyndan has ýokary çydamlylyga eýe we dürli çylşyrymly şablonlaryň PCR güýçlendirilmegine aňsatlyk bilen çydap bilýär.Üýtgeşik reaksiýa ulgamy we ýokary netijelilik Taq Gahrymany PCR reaksiýasyny güýçlendirmek netijeliligini, aýratynlygyny we duýgurlygyny ýokarlandyrýar.
Has ýokary güýçlendiriş netijeliligi
Onda 5 '→ 3' DNK polimeraza işjeňligi we 3 '→ 5' ekzonukleý işjeňligi bolmazdan 5 '→ 3' ekzonukleý işjeňligi bar.
Hakyky wagt PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Ificörite - optimallaşdyrylan bufer we gyzgyn başlangyç Taq fermenti, ýörite däl güýçlendirme we primer dimer emele gelmeginiň öňüni alyp biler
Highokary duýgurlyk - şablonyň pes nusgalaryny tapyp biler
Kitapda täsin “Foregene” ters transkripsiýa reagenti we “Foregene HotStar Taq DNA polimeraza” täsin reaksiýa ulgamy bilen birleşdirilip, reaksiýanyň güýçlendirme netijeliligini we aýratynlygyny ýokarlandyrýar.
Iş wagty: Maý-09-2023
