• PCR az mukdarda DNK şablonyndan DNK güýçlendirmek üçin ulanylýan usul.RT-PCR, soň güýçlendirilip bilinjek RNK çeşmesinden DNK şablonyny öndürmek üçin ters transkripsiýany ulanýar.
• PCR we RT-PCR adatça ahyrky nokat reaksiýalarydyr, qPCR we RT-qPCR bolsa, şablonyň mukdaryny kesgitlemek üçin PCR reaksiýasy wagtynda önüm sinteziniň tizliginiň kinetikasyny ulanýarlar.
• Sanly PCR ýaly täze usullar başlangyç DNK şablonynyň mukdaryny üpjün edýär, izotermiki PCR ýaly usullar ygtybarly netijeleri bermek üçin gymmat enjamlaryň zerurlygyny azaldýar.

Polimeraza zynjyryň reaksiýasy (PCR), DNK we RNK yzygiderliligini güýçlendirmek we kesgitlemek üçin has ýönekeý we giňden ulanylýan molekulýar biologiýa usulydyr.Köplenç birnäçe gün alyp bilýän DNK klonlaşdyrmagyň we güýçlendirmegiň adaty usullary bilen deňeşdirilende, PCR birnäçe sagat talap edýär.PCR ýokary duýgur we belli yzygiderliligi ýüze çykarmak we güýçlendirmek üçin minimal şablony talap edýär.Esasy PCR usullary ýönekeý DNK we RNK kesgitlemekden has ösdi.Aşakda, gözleg zerurlyklaryňyz üçin Enzo Life Science-de hödürleýän dürli PCR usullary we reagentleri barada umumy maglumat berdik.Alymlara indiki gözleg taslamasynda ulanmak üçin PCR reagentlerine tiz girmäge kömek etmegi maksat edinýäris!

PCR

Adaty PCR üçin size diňe DNK polimeraza, magniý, nukleotidler, primerler, güýçlendirilmeli DNK şablony we termosikler gerek.PCR mehanizmi maksady ýaly ýönekeý: 1) iki hatar DNK (dsDNA) ýylylyk denatirlenen, 2) primerler bir DNK hatarlaryna deňleşýär we 3) desgalar DNK polimeraza bilen uzalýar, netijede iki nusgasy asyl DNK zolagy.Birnäçe temperatura we döwür boýunça denaturasiýa, dykyzlyk we uzalma prosesi güýçlendirmegiň bir sikli hökmünde bellidir (1-nji surat).

Sikliň her ädimi ulanylýan şablon we primer toplumy üçin optimallaşdyrylmalydyr.Bu sikl takmynan 20-40 gezek gaýtalanýar we güýçlendirilen önümi adatça agarose jeli bilen analiz edip bolýar (2-nji surat).

PCR gaty duýgur usuldygy we ýekeje reaksiýa üçin gaty az göwrüm gerekdigi sebäpli, birnäçe reaksiýa üçin ussat garyndyny taýýarlamak maslahat berilýär.Esasy garyndy gowy garylyp, soňra reaksiýalaryň sanyna bölünip, her reaksiýanyň deň mukdarda ferment, dNTP we primer bolmagyny üpjün etmeli.Enzo Life Science ýaly köp üpjün edijiler, primerlerden we DNK şablonyndan başga hemme zady öz içine alýan PCR garyndylaryny hem hödürleýärler.

Guan / Sitosine baý (GC baý) sebitler adaty PCR usullarynda kynçylygy görkezýär.GC baý yzygiderliligi pes GC mazmuny bilen yzygiderlilige garanyňda has durnuklydyr.Mundan başga-da, GC-e baý yzygiderlilik, saç aýlawlary ýaly ikinji derejeli gurluşlary emele getirýär.Netijede, GC baý goşa setirleri denatasiýa döwründe doly aýyrmak kyn.Netijede, DNK polimeraza täze seti päsgelçiliksiz sintez edip bilmez.Has ýokary denaturasiýa temperaturasy muny gowulaşdyryp biler we has ýokary ýylylyk temperaturasyna we has gysga anneal wagtyna düzedişler GC baý primerleriň kesgitli baglanyşygynyň öňüni alyp biler.Goşmaça reagentler GC baý yzygiderliligini güýçlendirip biler.DMSO, gliserol we betaine GC täsirleri sebäpli dörän ikinji derejeli gurluşlary bozmaga kömek edýär we şeýlelik bilen goşa setirleriň bölünmegini aňsatlaşdyrýar.

“Hot Start PCR”

Kesgitli güýçlendirme PCR wagtynda ýüze çykyp bilýän mesele.PCR üçin ulanylýan DNK polimerazalarynyň köpüsi 68 ° C-den 72 ° C çenli has gowy işleýär.Ferment, has pes derejede bolsa-da, pes temperaturalarda işjeň bolup biler.Düwürtme temperaturasyndan has pes temperaturalarda, primerler buz bilen gurlsa-da, ýörite däl baglanyşyp biler we ýörite güýçlendirilmezlige sebäp bolup biler.DNK polimerazasyndan belli bir temperatura ýetensoň bölünýän polimeraza ingibitorlaryny ulanmak arkaly munuň öňüni alyp bolar, şonuň üçin gyzgyn başlangyç PCR termini.Inhibitor polimeraza we denaturany başlangyç denatasiýa temperaturasynda (adatça 95 ° C) baglanyşdyrýan antikor bolup biler.

Fokary wepaly polimeraza

DNK polimerazalary asyl şablon yzygiderliligine ýeterlik derejede güýçlendirilse-de, nukleotidiň gabat gelmeginde ýalňyşlyklar bolup biler.Klonirlemek ýaly programmalardaky gabat gelmezlikler kesilen ýazgylara we aşaky akymda bölünmedik ýa-da hereketsiz beloklara sebäp bolup biler.Bu gabat gelmezliklerden gaça durmak üçin “gözden geçiriş” işjeňligi bolan polimerazalar kesgitlenildi we iş prosesine goşuldy.Ilkinji barlag polimerazasy Pfu 1991-nji ýylda Pirokokk furiosusynda ýüze çykaryldy.Bu Pfu fermentiniň 3 '5' ekzonukleýasiýa işjeňligi bar.DNK güýçlendirilenden soň, ekzonukleýz süýümiň 3 'ujundaky gabat gelmedik nukleotidleri aýyrýar.Soňra dogry nukleotid çalşylýar we DNK sintezi dowam edýär.Nädogry nukleotid yzygiderliligini kesgitlemek, ferment bilen dogry nukleozid trifosfat üçin baglanyşyk ýakynlygyna esaslanýar, bu ýerde netijesiz baglanyşyk sintezi haýalladýar we dogry çalyşmaga mümkinçilik berýär.Pfu polimerazynyň gözden geçiriş işjeňligi, soňky yzygiderlilikde Taq DNK polimerazasy bilen deňeşdirilende az ýalňyşlyklara sebäp bolýar.Soňky ýyllarda beýleki gözden geçiriji fermentler ýüze çykaryldy we DNK güýçlendirilende ýalňyşlyk derejesini hasam peseltmek üçin asyl Pfu fermentine üýtgeşmeler girizildi.

RT-PCR

Tersine transkripsiýa PCR ýa-da RT-PCR, RNK-ny şablon hökmünde ulanmaga mümkinçilik berýär.Goşmaça ädim RNK-ny tapmaga we güýçlendirmäge mümkinçilik berýär.RNK tersine transkriptaz ulanyp, goşmaça DNK (CDNA) tersine ýazylýar.RT-PCR-iň üstünligi üçin RNK şablonynyň hili we arassalygy zerurdyr.RT-PCR-iň ilkinji ädimi DNK / RNA gibridiniň sintezi.Ters transkriptazda gibridiň RNK bölegini peseldýän RNase H funksiýasy hem bar.Bir hatar DNK molekulasy, tersine transkriptazyň CDNA-da DNK bagly DNK polimeraza işjeňligi bilen tamamlanýar.Birinji hatar reaksiýanyň netijeliligi güýçlendirme prosesine täsir edip biler.Bu ýerden, cDNA-ny güýçlendirmek üçin adaty PCR prosedurasy ulanylýar.RT-PCR tarapyndan RNK-ny cDNA-a öwürmek mümkinçiliginiň köp artykmaçlygy bar we ol esasan gen aňlatma derňewi üçin ulanylýar.RNK bir hatar we gaty durnuksyz, bu bolsa işlemegi kynlaşdyrýar.Adatça, biologiki nusgadaky RNK ýazgylaryny kesgitleýän qPCR-de ilkinji ädim bolup hyzmat edýär.

qPCR we RT-qPCR

Mukdar PCR (qPCR) köp sanly programma üçin nuklein kislotalary ýüze çykarmak, häsiýetlendirmek we mukdar taýdan kesgitlemek üçin ulanylýar.RT-qPCR-de, RNK transkripsiýalary köplenç ýokarda görkezilişi ýaly ilki bilen cDNA-a tersine ýazmak arkaly kesgitlenýär we soňra qPCR amala aşyrylýar.Adaty PCR-de bolşy ýaly, DNK üç gezek gaýtalanýan ädim bilen güýçlendirilýär: denaturasiýa, anneal we uzalma.Şeýle-de bolsa, qPCR-de floresan bellik, PCR-iň ösmegi bilen maglumatlary ýygnamaga mümkinçilik berýär.Bu usulyň, usullaryň we himiýalaryň köp bolmagy sebäpli köp peýdasy bar.

Boýag esasly qPCR (adatça ýaşyl), floresan bellik, dsDNA baglaýjy boýag ulanyp, güýçlendirilen DNK molekulalarynyň mukdaryny kesgitlemäge mümkinçilik berýär.Her sikliň dowamynda floresan ölçelýär.Floresan signaly köpeldilen DNK mukdaryna proporsional ýokarlanýar.Şeýlelik bilen, DNK “hakyky wagtda” kesgitlenýär (3-nji surat).Boýag esasly qPCR-iň kemçilikleri, bir gezekde diňe bir nyşanyň gözden geçirilmegi we boýagyň nusgadaky islendik ds-DNK bilen baglanyşmagydyr.

Derňew esasly qPCR-de her nusgada bir wagtyň özünde köp nyşana tapylyp bilner, ýöne bu başlangyçlardan başga-da ulanylýan maksatly gözlegleriň optimizasiýasyny we dizaýnyny talap edýär.Synag dizaýnlarynyň birnäçe görnüşi bar, ýöne iň ýaýran görnüşi ftorofor we söndürijini öz içine alýan gidroliz zondy.Floresan rezonans energiýa geçirijisi (FRET), barlag üýtgemänkä, floroforyň söndürijiniň üsti bilen çykmagynyň öňüni alýar.Şeýle-de bolsa, PCR reaksiýasy wagtynda, deslapky uzaldylanda we özüne bagly bolan yzygiderliligi güýçlendirilende barlag gidrolizlenýär.Synagyň ýarylmagy florofory söndürijiden aýyrýar we floresan güýçlenmegine bagly ýokarlanmagyna getirýär (4-nji surat).Şeýlelik bilen, zona esaslanýan qPCR reaksiýasyndan floresan signaly, nusgadaky barlanylýan maksat yzygiderliliginiň mukdaryna proporsionaldyr.Synag esasly qPCR boýag esasly qPCR-den has mahsus bolany üçin, köplenç qPCR esasly anyklaýyş gözleglerinde ulanylýan tehnologiýa.

Izotermiki güýçlendirme

Aboveokarda agzalan PCR, denaturasiýa, anneal we uzaldyş ädimleri üçin kameranyň temperaturasyny takyk ýokarlandyrmak we peseltmek üçin gymmat termosikl enjamlaryny talap edýär.Şeýle takyk enjamlara mätäç däl we ýönekeý suw hammamynda ýa-da gyzyklanma öýjüklerinde ýerine ýetirip boljak birnäçe usul döredildi.Bu usullara bilelikde izotermiki güýçlendirme diýilýär we ekspensial, çyzykly ýa-da kaskad güýçlendirmek esasynda işleýär.

Izotermiki güýçlendirişiň iň meşhur görnüşi, aýlawly izotermiki güýçlendirme ýa-da LAMP.LAMP şablon DNK ýa-da RNK güýçlendirmek üçin 65⁰C derejesinde ekspensial güýçlendirme ulanýar.LAMP ýerine ýetirilende, täze DNK sintez etmek üçin DNK polimerazasy bilen maksatly DNK sebitlerini doldurýan dört-alty sany primer ulanylýar.Bu desgalaryň ikisinde, beýleki primerlerdäki yzygiderliligi ykrar edýän we olary baglanyşdyrýan goşmaça yzygiderlilikler bar, täze sintez edilen DNK-da “aýlaw” gurluşynyň emele gelmegine mümkinçilik döredýär, soňra bolsa güýçlendirişiň indiki tapgyrlarynda başlangyç annealizasiýa kömek edýär.LAMP floresan, agarose gel elektroforezi ýa-da kolorimetriýa ýaly birnäçe usul bilen şekillendirilip bilner.Kolorimetriýa arkaly önümiň barlygyny ýa-da ýoklugyny göz öňüne getirmegiň we kesgitlemegiň aňsatlygy we zerur enjamlaryň ýoklugy LAMP-ny kliniki laboratoriýa synagy aňsat bolmadyk ýerlerde ýa-da nusgalary saklamak we daşamak üçin SARS-CoV-2 synagy üçin amatly görnüşe öwürdi. ýerine ýetirip bolmaýardy ýa-da ozal PCR termosikl enjamlary bolmadyk laboratoriýalarda.