1. Esasy bilimler (tejribe bölümini görmek isleseňiz, göni ikinji bölüme geçirmegiňizi haýyş edýäris)
Adaty PCR-iň emele gelen reaksiýasy hökmünde, Real Time PCR esasan floresan signalynyň üýtgemegi arkaly hakyky wagtda PCR güýçlendirme reaksiýasynyň her siklinde güýçlendiriji önümiň mukdarynyň üýtgemegine gözegçilik edýär we başlangyç şablony ct bahasy bilen adaty egriniň arasyndaky baglanyşyk arkaly mukdar taýdan seljerýär.
RT-PCR-iň anyk maglumatlaryesasy, floresan bosagasyweCt bahasy
| esasy: | 3-15-nji aýlawyň floresan bahasy, ölçegiň wagtal-wagtal ýalňyşlygy sebäpli ýüze çykýan esasy (esasy) bolup durýar. |
| Bosgun (bosagada): | Güýçlendirme egrisiniň ekspensial ösüş sebitinde degişli ýagdaýda kesgitlenen floresan kesgitleme çägine degişlidir, adatça esasy gyşarmanyň 10 essesinden. |
| KT bahasy: | Her reaksiýa turbasyndaky floresan bahasy bosaga ýetende PCR siklleriniň sanydyr. Ct bahasy başlangyç şablonyň mukdaryna ters proporsionaldyr. |
RT-PCR üçin umumy bellik usullary:
| usuly | artykmaçlygy | kemçilik | ulanylyş gerimi |
| SYBR GreenⅠ | Giň ulanylyşy, duýgur, arzan we amatly | Esasy talaplar ýokary, aýratyn däl zolaklara ýykgyn edýär | Dürli maksatly genleriň mukdar taýdan seljermesi, geniň aňladylyşy we transgen rekombinant haýwanlar we ösümlikler boýunça gözlegler üçin amatlydyr. |
| TaqMan | Gowy aýratynlyk we ýokary gaýtalanma | Bahasy ýokary we diňe belli maksatlar üçin amatly. | Patogen tapmak, neşe garşylygy gen gözlegleri, neşe serişdeleriniň netijeliligini bahalandyrmak, genetiki keselleri anyklamak. |
| molekulýar maýak | Specificokary aýratynlyk, floresan, pes fon | Bahasy ýokary, diňe belli bir maksat üçin amatly, dizaýny kyn we bahasy ýokary. | Genörite gen derňewi, SNP derňewi |
2. Synag ädimleri
2.1 Synag toparlary barada- toparda birnäçe guýy bolmaly we biologiki gaýtalanmalar bolmaly.
| ① | Boş gözegçilik | Synaglarda öýjükleriň ösüş ýagdaýyny kesgitlemek üçin ulanylýar |
| ② | Ativearamaz gözegçilik siRNA (ýörite däl siRNA yzygiderliligi) | RNAi hereketiniň aýratynlygyny görkeziň.siRNA 200nM konsentrasiýasynda belli bolmadyk stres jogaplaryny döredip biler. |
| ③ | Transfeksiýa reagent dolandyryşy | Öýjüklere transfeksiýa reagentiniň zäherliligini ýa-da maksatly geniň aňladylyşyna täsirini aýyryň |
| ④ | maksatly gen garşy siRNA | Maksatly geniň aňlatmasyny ýykyň |
| ⑤ (islege görä) | polo positiveitel siRNA | Synag ulgamyny we amaly meselelerini çözmek üçin ulanylýar |
| ⑥ (islege görä) | Floresan gözegçilik siRNA | Öýjük transfeksiýasynyň netijeliligini mikroskop bilen synlamak bolýar |
2.2 Astar dizaýnynyň ýörelgeleri
| Güýçlendirilen bölek ululygy | Iň gowusy 100-150bp |
| Esasy uzynlyk | 18-25bp |
| GC mazmuny | 30% -70%, has gowusy 45% -55% |
| Tm bahasy | 58-60 ℃ |
| Yzygiderlilik | Üznüksiz T / C-den gaça duruň;A / G üznüksiz |
| 3 ahyrky yzygiderlilik | GC baý ýa-da AT baýlardan gaça duruň;terminal bazasy has gowusy G ýa-da C;T-den gaça durmak iň gowusydyr |
| Goşmaça | Astaryň içinde ýa-da iki primeriň arasynda 3-den gowrak bazanyň goşmaça yzygiderliliginden gaça duruň |
| Aýratynlygy | Astar aýratynlygyny tassyklamak üçin partlama gözlegini ulanyň |
①SiRNA görnüşlere mahsus, dürli görnüşleriň yzygiderliligi başgaça bolar.
②SiRNA doňan guradylan poroşokda gaplanýar, otag temperaturasynda 2-4 hepde durnukly saklanyp bilner.
2.3 Öňünden taýýarlanmaly gurallar ýa-da reagentler
| Primer (içerki salgylanma) | Öňe we tersine ikisini goşmak bilen |
| Astarlar (maksatly gen) | Öňe we tersine ikisini goşmak bilen |
| Maksat Si RNA (3 zolak) | Adatça, kompaniýa 3 zolagy sintez eder, soň bolsa RT-PCR tarapyndan üçüsinden birini saýlar |
| Geçiriş toplumy | Lipo2000 we ş.m. |
| RNK çalt çykarmak toplumy | Geçirilenden soň RNK çykarmak üçin |
| Çalt ters transkripsiýa toplumy | cDNA sintezi üçin |
| PCR güýçlendirme toplumy | 2 × Super SYBR Greenaşyl qPCR Master Mix |
2.4 specificörite synag synaglarynda üns berilmeli meseleler barada:
①siRNA geçiş prosesi
1. Örtmek üçin 24 guýy tarelka, 12 guýy tabak ýa-da 6 guýy plastinka saýlap bilersiňiz (24 guýy plastinkanyň her guýusynda ortaça RNK konsentrasiýasy takmynan 100-300 ng / uL), öýjükleriň optimal transfeksiýa dykyzlygy 60% -80% ýa-da ondanam ýokary bolup biler.
2. Geçiriş ädimleri we anyk talaplar görkezmelere berk laýyk gelýär.
3. Geçirilenden soň, mRNA kesgitlemek (RT-PCR) ýa-da 48-96 sagadyň dowamynda (WB) belok tapmak üçin nusgalar 24-72 sagadyň dowamynda ýygnalyp bilner.
② RNK çykarmak prosesi
1. Ekzogen fermentler bilen hapalanmagynyň öňüni alyň.Esasan maskalary we ellikleri berk geýmegi öz içine alýar;sterilizasiýa edilen turbanyň maslahatlaryny we EP turbalaryny ulanmak;synagda ulanylýan suw RNase-erkin bolmaly.
2. Arassalygyny we hasyllylygyny ýokarlandyrjak çalt çykarmak toplumynda teklip edileninden iki esse köp etmek maslahat berilýär.
3. Galyndy suwuklygy RNK sütünine degmeli däldir.
③ RNK mukdary
RNK çykarylandan soň, göni Nanodrop bilen kesgitlenip bilner we iň az okalmagy 10ng / ul ýaly pes bolup biler.
Transkripsiýa prosesi
1. RT-qPCR-iň ýokary duýgurlygy sebäpli, indiki Ct-iň üýtgeşik bolmazlygy ýa-da statistiki derňew üçin SD gaty uly bolmazlygy üçin her nusga üçin azyndan 3 sany paralel guýy ýasalmaly.
2. Master garyndysyny doňdurmaň we eretmäň.
3. Her turba / deşik täze maslahat bilen çalşylmalydyr!Nusga goşmak üçin şol bir turbanyň ujuny yzygiderli ulanmaň!
4. Nusga goşulandan soň 96 guýy tarelkasyna berkidilen film, tabak bilen tekizlenmeli.Turbanyň diwaryndaky suwuklyk aşak akyp, howa köpürjiklerini aýryp biler ýaly, ony enjamda goýmazdan ozal merkezden gaçyryş iň gowusydyr.
Om Adaty egrilik derňewi
| Logarifmiki ösüş döwri ýok | Şablonyň ýokary konsentrasiýasy |
| KT bahasy ýok | Floresan signallary kesgitlemek üçin nädogry ädimler; desgalaryň ýa-da zondlaryň zaýalanmagy - onuň bitewiligini PAGE elektroforezi bilen kesgitläp bolýar; şablonyň ýeterlik mukdary; şablonlaryň zaýalanmagy - hapalaryň döremeginden we nusga taýýarlanylanda doňdurmakdan we eremeginden gaça durmak; |
| Ct> 38 | Güýçlendirmegiň pes netijeliligi;PCR önümi gaty uzyn;dürli reaksiýa komponentleri peselýär |
| Çyzykly güýçlendirme egrisi | Synaglar gaýta-gaýta doňdurma siklleri ýa-da ýagtylyga uzak wagtlap täsir etmek bilen bölekleýin peselip biler |
| Dublikli deşikleriň tapawudy aýratyn uly | Reaksiýa çözgüdi düýbünden eremeýär ýa-da reaksiýa ergini garylmaýar;PCR guralynyň ýylylyk hammamy floresan maddalar bilen hapalanýar |
2.5 Maglumatlaryň derňewi barada
QPCR-iň maglumat derňewini otnositel mukdarda we mutlak mukdarda bölmek mümkin.Mysal üçin, gözegçilik toparyndaky öýjükler bilen deňeşdirilende bejeriş toparyndaky öýjükler,
X geniniň mRNA näçe gezek üýtgeýär, bu deňeşdirme;belli bir mukdarda öýjükde, X geniniň mRNA
Näçe nusgasy bar, bu mutlak bahalandyrma.Adatça laboratoriýada iň köp ulanýan zadymyz mukdar taýdan mukdar usulydyr.Adatça,2-ΔΔct usulysynaglarda iň köp ulanylýar, şonuň üçin bu usul diňe bu ýerde jikme-jik giriziler.
2-ΔΔct usuly: Alnan netije, synag toparyndaky maksat geniniň gözegçilik toparyndaky maksatly gen bilen deňeşdirilende tapawudy.Maksatly geniň we içerki salgylanma geniniň güýçlendirme netijeliliginiň 100% -e ýakyn bolmagy we otnositel gyşarmanyň 5% -den geçmeli däldigi talap edilýär.
Hasaplama usuly aşakdaky ýaly:
Controlct gözegçilik topary = dolandyryş toparyndaky maksatly geniň ct bahasy - gözegçilik toparyndaky içerki salgylanma geniniň ct bahasy
Δct eksperimental topar = synag toparyndaky maksat geniniň ct bahasy - synag toparyndaky içerki salgylanma geniniň ct bahasy
ΔΔct = Δct synag topary-Δct dolandyryş topary
Ahyrynda, aňlatma derejesindäki köp tapawudy hasaplaň:
Fold = 2-ΔΔct üýtgediň (Excel funksiýasyna gabat gelýän POWER)
Degişli önümler:
Iş wagty: Maý-20-2023
