Ⅰ. Reaksiýa ulgamynyň duýgurlygyny ýokarlandyrmak:
1. Aýry-aýry ýokary derejeli RNK:
Üstünlikli cDNA sintezi ýokary derejeli RNK-dan gelýär.Qualityokary derejeli RNK iň azyndan jemi has uzyn bolmaly we EDTA ýa-da SDS ýaly ýazgy fermentlerini öz içine almaýan ingibitorlary öz içine almaýar.RNK-nyň hili, cDNA-a ýazyp boljak yzygiderlilik maglumatlarynyň iň ýokary bahasyny kesgitleýär.RNK-ny arassalamagyň umumy usuly izoosýanat / asidofenol ulanmagyň ädim usulydyr.RNase-iň hapalanmagynyň öňüni almak üçin, RNase baý (aşgazan asty mäzleri ýaly) nusgadan bölünen RNK, uzak möhletli saklamak üçin has ýokary hilli RNK-ny tygşytlamak üçin formaldegidiň saklanmagyny talap edýär.Syçan bagyryndan alnan RNK, bir hepde suwda saklanandan soň peseldi, syçanyň dalagyndan alnan RNK üç ýyl suwda saklanandan soň durnukly boldy.Mundan başga-da, 4kb-dan uly ýazgylar, kiçi ýazgylara garanyňda RNase zaýalanmagyny yzarlamak üçin has duýgur.Saklaýan RNK nusgasynyň durnuklylygyny ýokarlandyrmak üçin RNK ionyň metalmamininde eräp, -70 ° C saklanýar.RNK-ny tygşytlamak üçin ulanylýan tilid, RNK-ny peseldýän dürli jisim bolmaly däldir.Aşgazan asty mäzinden emele gelen RNK, azyndan bir ýyl metamlaminde saklanyp bilner.RNK ulanmaga taýyn bolanyňyzda, RNK-ny çökdürmek üçin aşakdaky usullary ulanyp bilersiňiz: NaCl-i 0,2 m we etanyň mukdaryndan 4 esse goşuň, otag temperaturasyny 3-5 minut goýuň we 10 000 × g merkezden gaçyryş çäresini 5 minut goýuň.
2. RNaseH işjeňligi bolmazdan ters transkriptaz ulanyň (RNaseH-) ：
CDNA sinteziniň uzynlygyny we hasyllylygyny ýokarlandyrmak üçin RNK inhibitorlary köplenç ters transkripsiýa reaksiýalaryna goşulýar.RNase inhibitory, buferleriň we DTT ýaly azaldýan serişdeleriň barlygynda ilkinji zynjyr sintez reaksiýasyna goşulýar, sebäbi CDNA-dan öňki sintez prosesi inhibitory denatirleýär we şeýlelik bilen RNK-ny peseldýän RNase goýberýär.Belok RNase inhibitory diňe RNase A, B, C tarapyndan RNK-nyň zaýalanmagynyň öňüni alýar we deride RNasesiň öňüni almaýar, şonuň üçin bu inhibitorlaryň ulanylmagyna garamazdan barmaklardan RNases girizmezlige üns bermeli.
Ters transkriptaz RNK-nyň cDNA öwrülmegini katalizleýär.M-MLV we AMV ikisiniň hem polimeraza işjeňligine goşmaça endogen RNaseH işjeňligi bar.RNaseH işjeňligi, RNK şablonlary bilen DNK primerleri ýa-da cDNA uzaldyş zolaklarynyň arasynda emele gelen heterozigot zolaklar üçin polimeraza işjeňligi bilen bäsleşýär we RNK-ny peseldýär: DNK toplumlarynda RNK zolaklary.RNaseH işjeňligi bilen zaýalanan RNK şablonlary, cDNA sinteziniň hasyllylygyny we uzynlygyny azaldyp, cDNA sintezi üçin täsirli substratlar hökmünde ulanylyp bilinmez.Şeýlelik bilen ters transkriptazyň RNaseH işjeňligini ýok etmek ýa-da ep-esli azaltmak uly peýdaly bolar.
SuperScriptⅡ ters transkriptaz, RNaseH-iň MMLV ters transkriptazasy we termoScript ters transkriptaz, RNaseH-iň AMV-si MMLV we AMV-den has doly CDNA öndürdi.RT-PCR duýgurlygy sintezlenen cDNA mukdaryna täsir edýär.ThermoScript AMV-den has duýgur.RT-PCR önümleriniň göwrümi, tersine transkriptazanyň cDNA-ny sintez etmek ukyby bilen çäklenýär, esasanam has uly Cdnas klonlaşdyrylanda.MMLV bilen deňeşdirilende, SuperScripⅡ uzyn RT-PCR önümleriniň öndürijiligini ep-esli ýokarlandyrdy.RNaseH-ters ters transkriptaz hem termiki durnuklylygy ýokarlandyrýar, şonuň üçin reaksiýa 37-42 normal kadadan ýokary temperaturalarda amala aşyrylyp bilner.Teklip edilýän sintez şertlerinde oligo (dT) primerleri we 10μCi [alfa-p] dCTP ulanyldy.Birinji zynjyryň umumy önümçiligi TCA ýagyş usuly bilen hasaplandy.Doly uzynlykdaky CDNA ululygy boýunça zolaklary aýyrmak we aşgar agaroza jelinde sanamak arkaly derňeldi.
3. Ters transkripsiýanyň ýylylygy tygşytlaýyş temperaturasyny ýokarlandyrmak ：
Has ýokary saklaýyş temperaturasy RNK-nyň ikinji derejeli gurluşyny açmaga we reaksiýanyň hasyllylygyny ýokarlandyrmaga kömek edýär.RNK şablonlarynyň köpüsi üçin RNK we primeri 65 ° C-de bufer ýa-da duzsyz saklamak, soň bolsa buzda çalt sowatmak ikinji derejeli gurluşlary ýok edýär we primerleri baglamaga mümkinçilik berýär.Şeýle-de bolsa, käbir galyplar termiki denaturasiýadan soňam ikinji derejeli gurluşa eýe.Bu kyn şablonlary güýçlendirmek ThermoScript ters transkriptazasy we güýçlendirme gowulandyrmak üçin ters transkriptaz reaksiýasyny has ýokary temperaturada ýerleşdirmek arkaly amala aşyrylyp bilner.Has ýokary saklaýyş temperaturasy aýratynlygy artdyryp biler, esasanam genlere mahsus primerleri (GSPS) ulanyp cDNA sintezi amala aşyrylanda (3-nji bölüme serediň).GSP ulanýan bolsaňyz, primeriň Tm bahasynyň garaşylýan temperatura bilen deňdigine göz ýetiriň.Oligo (dT) we 60 above-dan ýokary tötänleýin primerleri ulanmaň.Tötänleýin primerler 60 to çenli ýokarlanmazdan ozal 25 at 10 minutda saklanmalydyr.Has ýokary ters transkripsiýa temperaturasyny ulanmakdan başga-da, RNK / primer garyndysyny 65 at denatirleme temperaturasyndan göni transkripsiýa saklaýyş temperaturasyna geçirmek we gyzdyrylan 2 × reaksiýa garyndysyny (cDNA termiki başlangyç sintezi) goşmak arkaly aýratynlyk gowulaşyp biler.Bu çemeleşme, has pes temperaturada ýüze çykýan birek-birekli esasy jübütleşmegiň öňüni almaga kömek edýär.PCR guralyny ulanmak, RT-PCR üçin zerur bolan köp temperatura wyklýuçatelini aňsatlaşdyrýar.
Üçünji ýylylyk durnuklaşdyrylan polimeraza, Mg2 + we Mn2 + bar bolan RNK polimeraza gatnaşanda DNK polimeraza hökmünde hereket edýär.65 up çenli ýylylygy saklap bilýär.Şeýle-de bolsa, PCR wagtynda Mn2 + -iň bolmagy wepalylygy peseldýär, bu bolsa TD polimerazyny cDNA klonlaşdyryşy ýaly ýokary takyklyk güýçlendirmek üçin has amatly edýär.Mundan başga-da, Tth ters transkripsiýada az täsir edýär, bu duýgurlygy peseldýär we bir ferment ters transkripsiýany we PCR ýerine ýetirip bilýänligi sebäpli, CDNA-nyň güýçlendirilen önümlerini hapalanan genom DNK-laryndan tapawutlandyrmak üçin ters transkripsiýasyz gözegçilik reaksiýalary ulanylyp bilinmez.
4. Tersine transkripsiýany öňe sürýän goşundy ：
Ilkinji zynjyr sintez reaksiýasyna gliserin we DMSO ýaly goşundylaryň goşulmagy, nuklein kislotasynyň goşa süýüminiň durnuklylygyny peseldip we RNK ikinji derejeli gurluşyny açyp biler.SuperScriptⅡ ýa-da MMLV-iň işine täsir etmezden 20% -e çenli gliserin ýa-da 10% DMSO goşup bolýar.AMV, işjeňligi azaltmazdan, 20% -e çenli gliserola çydam edip biler.SuperScriptⅡ ters transkripsiýa reaksiýasynda RT-PCR duýgurlygyny ýokarlandyrmak üçin 10% gliserol goşulyp we 45 at izolýasiýa edilip bilner.Retrotranscript-reaksiýa önüminiň 1/10 bölegi PCR-e goşulsa, güýçlendirme reaksiýasyndaky gliserolyň konsentrasiýasy 0,4% bolup, PCR-ni saklamak üçin ýeterlik däl.
5. RNaseH gaýtadan işlemek ：
PCR-den öň RNaseH bilen cDNA sintez reaksiýalaryny bejermek arkaly duýgurlyk gowulaşyp biler.Käbir galyplar üçin, cDNA sintez reaksiýasyndaky RNK güýçlendirilen önümleriň baglanyşmagynyň öňüni alýar, bu ýagdaýda RNaseH bejergisi duýgurlygy artdyryp biler.Umuman alanyňda, RNaseH bejergisi az göçürme bilen inçekesel şeroz ýaly has uzyn doly CDNA maksatly şablony güýçlendirmek üçin zerurdyr.Bu kyn şablon üçin, RNaseH SuperScriptⅡ ýa-da AMV tarapyndan sintezlenen cDNA tarapyndan döredilen signaly güýçlendirdi.RT-PCR reaksiýalarynyň köpüsi üçin RNaseH bejergisi hökmany, sebäbi 95 ℃ izolirlenen PCR denatasiýa ädimi, adatça RNK-dan RNK gidrolizleýär: DNK toplumy.
6. Az mukdarda RNK kesgitlemegiň kämilleşdirilen usullary ：
Diňe az mukdarda RNK bar bolsa, RT-PCR aýratyn kyn.RNK bölünişiginde glikogeniň daşaýjy hökmünde goşulmagy ownuk nusgalaryň hasyllylygyny ýokarlandyrmaga kömek edýär.Trizol bilen bir wagtda RNase-den glikogen goşup bolýar.Glikogen suwda erär we indiki ýagyşlara kömek etmek üçin RNK bilen suw fazasynda galyp biler.RNase-den erkin glikogeniň maslahat berilýän konsentrasiýasy 50mg-dan az dokuma ýa-da 106 medeniýetli öýjük üçin 250μg / ml.
“SuperScriptⅡ” ulanyp, transkripsiýa reaksiýalaryna asetilleşdirilen BSA-nyň goşulmagy duýgurlygy ýokarlandyryp biler we az mukdarda RNK üçin SuperScriptⅡ mukdaryny azaldyp, 40 birlik RnaseOut nukleaza inhibitory goşup, kesgitlemek derejesini ýokarlandyryp biler.Glikogen RNK bölünişiginde ulanylsa, SuperScriptⅡ ulanyp transkripsiýa reaksiýalaryna BSA ýa-da RNase inhibitorlaryny goşmak maslahat berilýär.
Ⅱ. RT-PCR aýratynlygyny ýokarlandyryň
1. cNDA sintezi ：
Ilkinji hatar cDNA sintezini başlamak üçin üç dürli usul ulanylyp bilner we her usulyň otnositel aýratynlygy sintezlenen cDNA mukdaryna we görnüşine täsir edýär.
Tötänleýin başlangyç usuly üç usulyň iň azy.Primerler gysga, bölekleýin uzynlykly CDNA öndürmek üçin transkripsiýanyň dowamynda birnäçe saýtda berkidilýär.Bu usul köplenç ikinji derejeli gurluş sebitleri bolan RNK şablonlaryndan 5 ′ terminal yzygiderliligini we cDNA almak üçin ulanylýar ýa-da tersine transkriptazanyň köpeldip bilmeýän sahypalary bilen.Iň uzyn cDNA almak üçin, her RNK nusgasyndaky primerleriň RNK bilen gatnaşygy empirik taýdan kesgitlenmeli.Tötänleýin primerleriň başlangyç konsentrasiýasy 20μl reaksiýa ulgamyna 50-den 250ng aralygynda bolýar.Jemi RNK-dan sintez edilen CDNA esasan ribosomal RNK bolany üçin, poli (A) + RNA şablon hökmünde saýlanýar.
Oligo (dT) başlangyjy tötänleýin başlangyçlardan has anyk.Eukariotik öýjükleriň köpüsinde mRNA-nyň 3 ′ ujunda tapylan poli (A) guýrugy bilen gibridlenýär.Poli (A) + RNK umumy RNK-nyň takmynan 1% -den 2% -ine çenli bolany üçin, cDNA-nyň mukdary we çylşyrymlylygy tötänleýin primer ulanylandan has az.Oligo (dT) ýokary aýratynlygy sebäpli, RNK-nyň başlangyç gatnaşygy we poli (A) + saýlamasy üçin optimizasiýany talap etmeýär.20μl reaksiýa ulgamyna 0,5μg oligo (dT) ulanmak maslahat berilýär.oligo (dT) 12-18, RT-PCR-iň köpüsi üçin amatly.ThermoScript RT-PCR ulgamy, ýylylyk durnuklylygy sebäpli oligo (dT) 20 üpjün edýär we has ýokary temperatura üçin amatly.
Genlere mahsus primerler (GSP) ters transkripsiýa ädimi üçin iň oňat başlangyçlardyr.GSP antisense oligonukleozid bolup, tötänleýin primer ýa-da oligo (dT) ýaly ähli Rnalary dakmak däl-de, RNK niýetlenen yzygiderliligi bilen gibridlenip bilýär.PCR primerlerini dizaýn etmek üçin ulanylýan düzgünler ters transkripsiýa reaksiýasy GSP dizaýnyna-da degişlidir.GSP mRNA3 ′ ahyrynda berkidilen güýçlendiriji primer bilen birmeňzeş bolup biler, ýa-da GSP ters güýçlendiriji primeri bilen aşak akymda birleşdirilip bilner.Käbir güýçlendirilen obýektler üçin üstünlikli RT-PCR üçin birden köp antisense primeri dizaýn etmeli, sebäbi maksatly RNK-nyň ikinji derejeli gurluşy primeriň baglanmagynyň öňüni alyp biler.20μl ilkinji zynjyr sintez reaksiýa ulgamynda 1pmol antisense GSP ulanmak maslahat berilýär.
2. Ters transkripsiýanyň ýylylygy tygşytlaýyş temperaturasyny ýokarlandyrmak ：
GSP aýratynlygyndan doly peýdalanmak üçin ýokary ýylylyk durnuklylygy bolan ters transkriptaz ulanylmaly.Reaksiýanyň berkligini ýokarlandyrmak üçin ýylylyk durnukly ters transkriptaz has ýokary temperaturada izolýasiýa edilip bilner.Mysal üçin, bir GSP 55 ° C-de garylan bolsa, ters transkripsiýa 37 ° C-de AMV ýa-da M-MLV ulanyp pes berklik bilen ýerine ýetirilse, GSP-iň aýratynlygy doly ulanylmaýar.Şeýle-de bolsa, “SuperScripⅡ” we “ThermoScript” 50 ℃ ýa-da ondanam ýokary reaksiýa berip biler, bu bolsa pes temperaturada öndürilen belli önümleri ýok edýär.Iň ýokary aýratynlyk üçin, RNK / primer garyndysy, gyzdyrylan 2 x reaksiýa garyndysyny (cDNA sinteziniň termiki başlangyjy) goşmak bilen 65 ℃ denatasiýa temperaturasyndan ters transkripsiýa temperaturasyna gönüden-göni geçirilip bilner.Bu pes temperaturada molekulalaryň arasynda jübütleşmegiň öňüni almaga kömek edýär.PCR guralyny ulanmak, RT-PCR üçin zerur bolan köp temperatura geçişini aňsatlaşdyrýar.
3. Genomiki DNK hapalanmagyny azaltmak ：
RT-PCR bilen ýüze çykyp biljek kynçylyklaryň biri, RNK genom DNK-ny hapalamakdyr.Trizol Reagent ýaly has gowy RNK bölmek usullarynyň ulanylmagy, RNK taýýarlyklarynda genom DNK hapalanmagyny azaldar.Genomiki DNK-dan öndürilen önümlerden gaça durmak üçin RNK güýçlendirme derejesi DnasⅠ bilen bejerilip bilner, tersine transkripsiýadan öň hapalanan DNK-ny aýyrmak üçin.DNaseⅠ iýmit siňdirişini bes etmek üçin nusgalar 2.0mM EDTA-da 65 at 10 minutda saklandy.EDTA, ýokary temperaturada ýüze çykýan magniý ionyna bagly RNK gidroliziniň öňüni almak üçin magniý ionlaryny çişirýär.
Güýçlendirilen cDNA-ny gen DNK güýçlendiriji önüminden aýyrmak üçin, aýry-aýry ekzon bilen aýry-aýry anneal primerler dizaýn edilip bilner.CDNA-dan alnan PCR önümleri hapalanan genom DNK-dan has gysga bolar.Tersine transkripsiýasyz gözegçilik edilýän synag, her bir RNK şablonynda berlen bölek genom DNK-dan ýa-da cDNA-dan däldigini anyklamak üçin hem geçirilýär.Ters transkripsiýa bolmadyk ýagdaýynda alnan PCR önümleri genomdan alnan.
Baglanyşykly önüm
-Bir ädimli toplum ters transkripsiýany we PCR-ni şol bir turbada amala aşyrmaga mümkinçilik berýär.Diňe RNA şablony, ýörite PCR primerleri we RNase-Free ddH goşmaly2O.
- RNK-nyň hakyky mukdarda derňewi çalt we takyk amala aşyrylyp bilner.
- Kitapda täsin Foregene ters transkripsiýa reagenti we Foregene HotStar Taq DNK polimerazasy, reaksiýanyň güýçlendirmek netijeliligini we aýratynlygyny netijeli ýokarlandyrmak üçin özboluşly reaksiýa ulgamy bilen bilelikde ulanylýar.
- Optimallaşdyrylan reaksiýa ulgamy, reaksiýany has ýokary duýgurlyga, ýylylyk durnuklylygyna we has oňat çydamlylyga eýe edýär.
- 2 minutyň içinde şablondaky gDNA-ny aýryp bilýän gDNA-ny aýyrmak üçin ýeterlik ukyp.
- Netijeli ters transkripsiýa ulgamy, birinji setir CDNA-nyň sintezini tamamlamak üçin bary-ýogy 15 minut gerek.
-Kompleks şablonlar: ýokary GC mazmuny we çylşyrymly ikinji derejeli gurluşly şablonlar hem ýokary netijelilik bilen tersine bolup biler.
- highokary duýgurlyk ters transkripsiýa ulgamy, pg derejeli şablonlar hem ýokary hilli cDNA alyp bilerler.
- Tersine transkripsiýa ulgamy ýokary ýylylyk durnuklylygyna, iň amatly reaksiýa temperaturasyna 42 is, henizem 50 at derejesinde ters transkripsiýa ýerine ýetirijiligine eýe.
Iş wagty: 07-nji mart -2023
