RT-qPCR adaty PCR tehnologiýasyndan işlenip düzüldi.Adaty PCR reaksiýa ulgamyna floresan himiki maddalary (floresan boýaglar ýa-da floresan zondlar) goşýar we dürli lýumesent mehanizmlerine laýyklykda PCR anneal we uzalma prosesini anyklaýar.PCR-iň her siklinde önümiň üýtgemeginiň mukdaryny hasaplamak üçin gurşawdaky floresan signalyň üýtgemegi ulanylýar.Häzirki wagtda iň köp ýaýran usullar floresan boýag usuly we gözleg usulydyr.

Floresan boýag usuly:
SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO we ş.m. ýaly käbir floresan boýaglar öz-özünden ýagtylyk bermeýär, ýöne dsDNA-nyň kiçi çukuryna baglanandan soň floresan çykarýar.Şonuň üçin PCR reaksiýasynyň başynda enjam floresan signalyny tapyp bilmeýär.Haçan-da reaksiýa uzaldyş (iki basgançakly usul) ýa-da uzaldyş tapgyryna (üç basgançakly usul) geçende, goşa zolaklar şu wagt açylýar we täze DNK polimeraza Çyzgy sintezi wagtynda floresan molekulalary dsDNA ownuk çukurda birleşýär we floresan çykýar.PCR siklleriniň sanynyň köpelmegi bilen has köp boýag dsDNA bilen birleşýär we floresan signal hem yzygiderli güýçlenýär.Mysal hökmünde SYBR Green alyň.
Gözleg usuly:
Takman zondy iň köp ulanylýan gidroliz zondy.Synagyň 5 ′ ujunda, adatça FAM-da floresan topar bar.Synagyň özi maksatly geniň üstüni ýetirýän yzygiderlilikdir.Ftoroforyň 3 ′ ujunda floresan söndüriji topar bar.Floresan rezonans energiýa geçirijisi (Förster rezonans energiýa geçirijisi, FRET) prinsipine görä, habarçy floresan topary (donor floresan molekulasy) we söndüriji floresan topary (kabul ediji floresan molekulasy) Tolkundyryş spektri biri-birine gabat gelende we aralyk gaty ýakyn bolsa (7-10nm), donor molekulasynyň tolgunmagy kabul edijiniň molekulasynyň floresanlygyny döredip biler.Şonuň üçin PCR reaksiýasynyň başynda, zond erkin we ulgamda üýtgemese, habarçy floresan topary floresan çykarmaz.Düwürdilende primer we zond şablona baglanýar.Giňeldiş döwründe polimeraza täze zynjyrlary yzygiderli sintez edýär.DNK polimeraza 5′-3 ′ ekzonukleýasiýa işjeňligi bar.Synaga ýeteniňde, DNK polimeraza zondy şablondan gidroliz eder, habarçy floresan toparyny söndüriji floresan toparyndan aýyrar we floresan signalyny çykarar.Synag bilen şablonyň arasynda ýeke-täk baglanyşyk barlygy sebäpli, synag usuly synagyň takyklygy we duýgurlygy taýdan boýag usulyndan has ýokarydyr.

1-nji surat qRT-PCR ýörelgesi

Esasy dizaýn
Iplesörelgeler:

Astarlar nuklein kislotasynyň seriýasynyň goralýan sebitinde dizaýn edilmelidir we aýratynlygy bolmaly.

CDNA yzygiderliligini ulanmak iň gowusy, mRNA yzygiderliligi hem kabul ederliklidir.Notok bolsa, DNK yzygiderliliginiň cds sebit dizaýnyny tapyň.
Floresan mukdar önüminiň uzynlygy 80-150bp, iň uzynlygy 300bp, başlangyç uzynlygy adatça 17-25 bazanyň arasynda, ýokarky we aşaky akymlaryň arasyndaky tapawut gaty uly bolmaly däldir.

G + C mazmuny 40% bilen 60% arasynda, 45-55% iň gowusy.
TM bahasy 58-62 dereje.
Astar ölçeglerden we öz-özüňi ölçemekden gaça durmaga synanyşyň, (yzygiderli 4 jübütden köp goşmaça esaslar görünmeýär) saç düzümi, gutulgysyz bolsa, ΔG <4.5kJ / mol * Tersine transkripsiýa wagtynda gDNA-nyň aýrylandygyny kepillendirip bilmeseňiz, iň gowusy, içerki / 3 ′ ujundaky desgalary üýtgedip bolmaz, G / GC
Aýratyn birmeňzeş güýçlendirilen yzygiderliligiň gomologiýasy has gowusy 70% -den az ýa-da 8 sany goşmaça esasy gomologiýa eýe.
Maglumatlar bazasy:
Açar sözler bilen CottonFGD gözlegi
Esasy dizaýn:
IDT-qPCR başlangyç dizaýny

Fig2 IDT onlaýn primer dizaýn gural sahypasy

3-nji surat sahypasynyň ekrany
LncRNA desgalarynyň dizaýny:
lncRNA:mRNA ýaly ädimler.
miRNA:“Stem-loop” usulynyň ýörelgesi: mihli miRNA-lar takmynan 23 nt gysga yzygiderlilik bolansoň, göni PCR kesgitläp bolmaýar, şonuň üçin stem-loop yzygiderliligi gural ulanylýar.Düwürtik yzygiderliligi takmynan 50 nt bolan bir hatar DNK bolup, özi saç düzümini emele getirip biler.3 'Ahyry, miRNA bölek bölekleriniň üstüni ýetirýän yzygiderlilik hökmünde düzülip bilner, soň maksatly miRNA ters transkripsiýa wagtynda sap aýlaw yzygiderliligine birikdirilip bilner we umumy uzynlygy qPCR tarapyndan kesgitlenen güýçlendirilen önümiň uzynlygyna laýyk 70bp ýetip biler.Guýruk miRNA başlangyç dizaýny.
Güýçlendirmek aýratynlygy:
Onlaýn partlama maglumatlar bazasy: PagtaFGD yzygiderli meňzeşlik boýunça partlama
Localerli partlama: partlama partlamasy üçin “Blast +” -e ýüz tutuň, linux we makos gönüden-göni ýerli maglumat bazasyny döredip biler, “ubu10 bash” gurlandan soň win10 ulgamy hem edilip bilner.Localerli partlama maglumatlar bazasyny we ýerli partlamany dörediň;win10-da ubuntu bash açyň.
Üns beriň: landokarky pagta we deňiz adasyndaky pagta tetraploid ekinler, şonuň üçin partlamanyň netijesi köplenç iki ýa-da has köp gabat gelýär.Geçmişde partlama amala aşyrmak üçin NAU cds-ni maglumat bazasy hökmünde ulanmak, diňe birnäçe SNP tapawudy bolan iki sany gen genini tapmagy ähtimal.Adatça, iki birmeňzeş geni başlangyç dizaýn bilen bölüp bolmaýar, şonuň üçin olara birmeňzeş seredilýär.Belli bir indel bar bolsa, primer adatça indeliň üstünde işlenip düzülýär, ýöne bu primeriň ikinji derejeli gurluşyna sebäp bolup biler Erkin energiýa has ýokary bolup, güýçlendiriş netijeliliginiň peselmegine sebäp bolup biler, ýöne bu gutulgysyz.

Esasy ikinji derejeli gurluşy kesgitlemek:
Dimler:açyk oligo 7 → giriş şablon yzygiderliligini → kiçi penjire ýapyň → ýatda saklaň → şablonda primeri tapyň, başlangyç uzynlygyny kesgitlemek üçin ctrl + D basyň → öz-özüni ölçemek korpusy, heterodimer, saç çyzgysy, gabat gelmezlik we ş.m. ýaly dürli ikinji derejeli gurluşlary derňäň.Öňki desganyň netijesi gowy, aç-açan ölçegli we saç düzümi ýok, üznüksiz goşmaça esaslar ýok we erkin energiýanyň mutlak bahasy 4,5-den pes, yzky primer üznüksiz görkezýär 6 esas biri-biriniň üstüni ýetirýär, erkin energiýa bolsa 8,8;Mundan başga-da, 3 ′ ujunda has çynlakaý ölçeg we yzygiderli 4 bazanyň ölçegi peýda bolýar.Erkin energiýa ýokary bolmasa-da, 3 ′ ölçegli Chl güýçlendirme aýratynlygyna we güýçlendirme netijeliligine çynlakaý täsir edip biler.Mundan başga-da, saç gysgyçlaryny, heterodizatorlary we gabat gelmeýän zatlary barlamaly.

Fig3 oligo7 tapmagyň netijeleri
Güýçlendirmek netijeliligini kesgitlemek:
PCR reaksiýasynyň güýçlendirme netijeliligi PCR netijelerine çynlakaý täsir edýär.Şeýle hem, qRT-PCR-de güýçlendirmek netijeliligi mukdar netijeleri üçin aýratyn möhümdir.Reaksiýa buferindäki beýleki maddalary, maşynlary we protokollary aýyryň.Astarlaryň hili, qRT-PCR güýçlendirmek netijeliligine-de uly täsir edýär.Netijeleriň takyklygyny üpjün etmek üçin, deňeşdirilen floresan mukdary we mutlak floresan mukdary primerleriň güýçlendirme netijeliligini kesgitlemeli.Netijeli qRT-PCR güýçlendirmek netijeliliginiň 85% bilen 115% aralygyndadygy ykrar edildi.Iki usul bar:
1. Adaty egrilik usuly:
a.CDNA garyşdyryň
b.Gradient seýreklemek
c.qPCR
d.Güýçlendirmek netijeliligini hasaplamak üçin çyzykly regressiýa deňlemesi
2. LinRegPCR
LinRegPCR, SYBR Green ýa-da şuňa meňzeş himiýa esaslanýan mukdar PCR (qPCR) maglumatlary diýlip atlandyrylýan hakyky wagt RT-PCR Maglumatlaryny derňemek üçin programma.Programma esasy däl düzedilen maglumatlary ulanýar, her nusgada esasy düzedişleri aýratyn ýerine ýetirýär, penjiräniň çyzyklylygyny kesgitleýär we PCR maglumatlar toplumynyň üsti bilen göni çyzyklara laýyk çyzykly regressiýa derňewini ulanýar.Bu setiriň eňňidinden her aýratyn nusganyň PCR netijeliligi hasaplanýar.Amplikon üçin ortaça PCR netijeliligi we her nusga üçin Ct bahasy, özbaşdak floresan birliklerinde aňladylýan başlangyç konsentrasiýany hasaplamak üçin ulanylýar.Maglumatlary girizmek we çykarmak Excel elektron tablisasy arkaly.Diňe nusga
garyşdyrmak talap edilýär, gradient ýok
ädimler zerurdyr:(Mysal üçin Bole CFX96 alyň, düşnükli ABI bilen enjam däl)
synag:adaty qPCR synag.
qPCR maglumatlary çykarmak:LinRegPCR çykyş faýllarynyň iki görnüşini tanap biler: RDML ýa-da mukdar güýçlendirme netijesi.Aslynda, bu sikl belgisiniň we floresan signalynyň real wagt kesgitleme bahasydyr we güýçlendirme çyzykly segment netijeliliginiň floresan üýtgeme bahasyny seljermek arkaly alynýar.
Maglumat saýlamak: Teoriýa boýunça RDML bahasy ulanylmaly.Kompýuterimiň meselesi, programma üpjünçiliginiň RDML-ni tanap bilmezligi, şonuň üçin asyl maglumat hökmünde Excel çykyş bahasy bar.Ilki bilen maglumatlaryň gödek barlagyny geçirmek maslahat berilýär, mysal üçin nusgalary goşmazlyk we ş.m. Ballar çykyş maglumatlarynda öçürilip bilner (elbetde, olary pozup bilmersiňiz, LinRegPCR indiki döwürde bu nokatlary äsgermezlik eder)

Surat 5 qPCR maglumat eksporty

Dalaşgärleriň nusgalaryny saýlamak

Maglumatlaryň girizilmegi:Kwalifikasiýa güýçlendiriş netijeleri.xls, → açyk LinRegPCR → faýl → Excel-den oka 7 7-nji suratda görkezilişi ýaly parametrleri saýlaň → Bolýar → basyň

LinRegPCR maglumatlary girizmegiň 7-nji ädimleri

Netije:Gaýtalama bolmasa, toparlaşdyrmak hökman däl.Gaýtalama bar bolsa, toparlary nusga toparlarynda redaktirläp bolýar we kesgitleýjä geniň ady girizilýär we şol bir gen awtomatiki toparlanar.Ahyrynda faýla basyň, Excel eksport ediň we netijeleri görüň.Güýçlendirmek netijeliligi we her guýynyň R2 netijeleri görkeziler.Ikinjiden, toparlara bölseňiz, düzedilen ortaça güýçlendirme netijeliligi görkeziler.Her primeriň güýçlendirme netijeliliginiň 85% bilen 115% aralygyndadygyna göz ýetiriň.Örän uly ýa-da gaty kiçi bolsa, primeriň güýçlendirme netijeliliginiň pesdigini aňladýar.

8-nji surat Netijeler we maglumatlar

Synag prosesi:
RNK hil talaplary:
Arassalygy:1.72.0 galyndy izotiosýanatyň bolup biljekdigini görkezýär.Arassa nuklein kislotasy A260 / A230 2 töweregi bolmaly .Eger 230 nm güýçli siňdiriş bar bolsa, fenat ionlary ýaly organiki birleşmeleriň bardygyny görkezýär.Mundan başga-da, 1,5% agarose gel elektroforezi bilen kesgitlenip bilner.Markeri görkeziň, sebäbi ssRNA-da denaturasiýa ýok we molekulýar agram logarifminiň çyzykly gatnaşygy ýok we molekulýar agramy dogry beýan edip bolmaýar.Konsentrasiýa: Nazary taýdandäl100ng / ul-dan az, eger konsentrasiýa gaty pes bolsa, arassalygy adatça pes däl

Fig9 RNA jeli

Mundan başga-da, nusga gymmatly bolsa we RNK konsentrasiýasy ýokary bolsa, çykarylandan soň ony ýok etmek we RNK-ny ters transkripsiýa üçin iň soňky konsentrasiýasyna 100-300ng / ul goýmak maslahat berilýär.Inters transkripsiýa, mRNA transkripsiýa edilende, poliA guýruklaryna ýörite baglap bilýän oligo (dt) primerleri ters transkripsiýa üçin ulanylýar, lncRNA we circRNA bolsa umumy RNK-nyň ters transkripsiýasy üçin tötänleýin geksamer (Random 6 mer) primer ulanylýar, miRNA üçin miRNA-a mahsus boýn aýlawly primerler ulanylýar.Köp kompaniýalar indi ýörite guýruk enjamlaryny satuwa çykardylar.Baldak aýlaw usuly üçin guýruk usuly has amatly, ýokary geçirijilikli we reagent tygşytlaýjydyr, ýöne bir maşgalanyň miRNA-laryny tapawutlandyrmagyň täsiri stem-loop usuly ýaly gowy bolmaly däldir.Her ters transkripsiýa toplumynda genlere mahsus primerleriň (stem-loop) konsentrasiýasy üçin talaplar bar.MiRNA üçin ulanylýan içerki salgylanma U6.Düwürtik öwrülişigi wagtynda U6 turbasy aýratyn tersine öwrülmeli we U6-nyň öň we arka desgalary göni goşulmaly.CircRNA we lncRNA ikisi hem HKG-leri içerki salgylanma hökmünde ulanyp bilerler.IncDNA kesgitlemek,
RNK bilen baglanyşykly mesele ýok bolsa, cDNA hem gowy bolmaly.Şeýle-de bolsa, synagyň kämilligi dowam etdirilse, gDNA-ny CD-den tapawutlandyryp biljek içerki salgylanma genini (Reference gen, RG) ulanmak iň gowusydyr.Umuman, RG öý hyzmaty genidir., HKG) 10-njy suratda görkezilişi ýaly;Şol wagt men soýa saklaýan belok ýasaýardym we içki salgylanma hökmünde içini öz içine alýan aktin7 ulanýardym.GDNA-da bu primeriň güýçlendirilen bölekiniň ululygy 452bp, eger cDNA şablon hökmünde ulanylsa, 142bp.Soňra synag netijeleri, cDNA-nyň bir böleginiň hakykatdanam gDNA bilen hapalanandygyny we ters transkripsiýanyň netijesinde hiç hili problemanyň ýokdugyny we PCR üçin şablon hökmünde ulanylyp bilinjekdigini görkezdi.Agarose gel elektroforezini göni CDNA bilen işletmegiň peýdasy ýok, we ynandyryjy däl ýaýradyjy zolak.

10-njy surat CDNA tapmak

QPCR şertlerini kesgitlemekköplenç toplumyň teswirnamasyna laýyklykda hiç hili mesele ýok, esasan tm bahasy ädiminde.Käbir desgalar deslapky dizaýn wagtynda gowy işlenmedik bolsa, tm bahasy bilen teoretiki 60 ° C arasynda uly tapawut ýüze çyksa, nusgalar garylandan soň, gradiýent PCR-ni primerler bilen işletmek we TM bahasy hökmünde zolaksyz temperaturany kesgitlemezlige synanyşmak maslahat berilýär.

Maglumatlaryň derňewi

Adaty otnositel floresan mukdar PCR gaýtadan işlemek usuly esasan 2-e laýyklykda-ΔΔCT.Maglumatlary gaýtadan işlemek şablony.

Degişli önümler:

Hakyky wagt PCR aňsat^TM Takman

Hakyky wagt PCR aňsat^TM YSYBR REaşyl I.

RT Easy I (birinji setirli CDNA sintezi üçin Master Premix)

RT Easy II (qPCR üçin birinji setirli CDNA sintezi üçin Master Premix)