COVID-19 agyr ýiti dem alyş sindromy Coronavirus 2-nji görnüşi sebäpli ýüze çykýan ýokanç keseldir. Adam ýokaşanda iň köp ýaýran alamatlar gyzzyrma, üsgülewük we dem gysmakdyr.

Synag üçin ulanylýan nusgalary nazofargeal çişler ýa-da orofargeal çişler bilen ýygnap bolýar.

PCR näme?

Koronawirusy kesgitlemegiň adaty usuly polimeraza zynjyr reaksiýasy, PCR.Bu molekulýar biologiýada giňden ulanylýan usul.Millionlarça belli DNK böleklerine çaltlyk bilen göçürip biler.

Täze koronawirusda gaty uzyn bir hatar RNK genomy bar.Bu wiruslary PCR arkaly ýüze çykarmak üçin RNK molekulalary ters transkriptaz arkaly goşmaça DNK yzygiderliligine öwrülmelidir, soňra täze sintezlenen DNK adaty PCR proseduralary bilen güýçlendirilip bilner, bu adatça RT-PCR diýilýär.

RT-PCR prosesi

RNK çykarmak

Bu usuly ýerine ýetirmek üçin wirusly RNK esasan çykarylmaly.Amatly, çalt we täsirli aýralyk üçin dürli RNK arassalaýjy enjamlar ulanylyp bilner.

Söwda toplumy arkaly wirusly RNK çykarmak üçin ilki nusgany mikrosentrifuga turbasyna goşuň we soňra liz buferi bilen garmaly.Bufer ýokary denatirlenen we adatça fenoldan we guanidin izotiosýanatdan durýar.Mundan başga-da, wirusly RNK-nyň izolýasiýasyny üpjün etmek üçin liz buferinde RNase inhibitorlary bar.

Liz buferini goşanyňyzdan soň, garyjy turbany impuls bilen guruň we otag temperaturasynda inkubasiýa ediň.Wirus soňra liz buferi tarapyndan üpjün edilýän ýokary denatasiýa şertlerinde lizlenýär.

Nusga lizlenenden soň, arassalamak üçin sentrifuga turbasy ulanylýar.Nusga sentrifuga turbasyna ýüklenýär we soňra merkezden gaçyrylýar.

Bu amal, stasionar faza kremniniň gel matrisasyndan ybarat gaty faza çykarmak usulydyr.

Iň amatly duz we pH şertlerinde RNK molekulalary kremniniň membranasyna baglanýar.

Şol bir wagtyň özünde belok we beýleki hapalar aýrylýar.

Merkezden gaçyryşdan soň, sentrifuga turbasyny arassa ýygnamak turbasyna salyň, süzgüçi taşlaň we ýuwujy bufer goşuň.

Turbany membrananyň üsti bilen ýuwmak üçin buferi gaýtadan sentrifuga salyň.Bu membranadan galan ähli hapalary aýyrar we diňe RNK kremniniň jeline bagly bolar.

Nusga ýuwlandan soň, turbany arassa mikrosentrifuge turbasyna salyň we elýusiýa buferini goşuň.

Soňra elitasiýa buferini membrananyň üsti bilen mejbur etmek üçin merkezden gaçyrylýar.Elýusiýa buferi aýlaw sütüninden wirusly RNK-ny aýyrýar we beloklardan, ingibitorlardan we beýleki hapalaýjylardan arassalanan RNK alýar.

2-nji ädim

Garyşyk konsentrat

Wirusly RNK çykarylandan soň indiki ädim reaksiýa garyndysyny PCR güýçlendirmek üçin taýýarlamakdyr.Bu ädimde konsentrat ulanylýar.Bu konsentrirlenen çözgüt, premiksden, ters transkriptazadan, nukleotidlerden, öňe primerden, ters primerden, TaqMan zondyndan we DNK polimerazyndan ybarat deslapky konsentrirlenen çözgütdir.

Ahyrynda bu reaksiýa garyndysyny tamamlamak üçin RNK şablony goşulýar.Turbalar impuls worteksing bilen garylýar we reaksiýa garyndysy PCR plastinkasyna ýüklenýär.PCR plastinkasynda adatça 96 guýy bar we bir wagtyň özünde birnäçe nusgany seljerip biler.

3-nji ädim

PCR güýçlendirmek

Ondan soň, termiki welosipedli PCR maşynyna ýerleşdiriň.

Real-wagt RT-PCR, RdrRP geni, E geni we N genindäki maksat yzygiderliligini güýçlendirip, 2019-njy ýyldaky koronawirusy ýüze çykarmak üçin ulanylýar.Maksatly geniň saýlanylmagy başlangyç we gözleg yzygiderliligine baglydyr.

RT-PCR-iň ilkinji ädimi ters transkripsiýa.Bir-biriniň üstüni ýetirýän DNK-nyň birinji hatary, wirusly RNK geniniň goşmaça bölegine baglanýan PCR ters primeri bilen başlanan sintez edilýär.Soňra ters transkriptaz, wirusly RNK bilen goşmaça DNK sintez etmek üçin primeriň 3-nji bölegine DNK nukleotidleri goşýar.Bu ädimiň temperaturasy we dowamlylygy primerlere, maksatly RNK we ulanylýan ters transkriptaza baglydyr.

Ondan soň, RNA-DNK gibridiniň denaturasiýasyna getirýän başlangyç denatasiýa ädimi ulanylýar.Bu ädim DNK polimerazyny işjeňleşdirmek üçin zerurdyr.Şol bir wagtyň özünde ters transkriptaz hereketsiz.

PCR ýylylyk siklleriniň tapgyryndan durýar.Her sikl denaturasiýa, anneal we giňeltmek ädimlerinden durýar.

Denaturasiýa ädimi reaksiýa kamerasyny 95 gradusa çenli gyzdyrmagy we iki hatar DNK şablonyny denatasiýa üçin ulanmagy öz içine alýar.

Indiki ädimde, reaksiýanyň temperaturasy 58 gradusa çenli peselýär we öňe gidýän desganyň bir hatar DNK şablonynyň goşmaça bölegine ýakynlaşmagyna mümkinçilik berýär.Annealing temperaturasy asmanyň uzynlygyna we düzümine gönüden-göni baglydyr.

Giňeldiş ädiminde, DNK polimeraza DNK şablon zolagy bilen üstüni ýetirýän täze DNK setirini sintez edýär.Reaksiýa garyndysyndan 5′to 3 ′ ugry boýunça şablona goşmaça ýadrolary goşmak bilen.Bu ädimiň temperaturasy ulanylýan DNK polimeraza baglydyr.

Birinji aýlawdan soň iki hatar DNK nyşany alynýar.

Soňra ikinji aýlawy giriziň.Iki hatar DNK iki hatar DNK molekulasyny öndürmek üçin bölünýär.

Indiki ädimde reaksiýanyň temperaturasy peselýär, primerler her bir hatar DNK şablonyna birikdirilýär we Taq-man zondy maksatly DNK-nyň goşmaça bölegine birikdirilýär.

TaqMan zondy, oligonukleotid zondynyň 5′endine kowal taýdan bagly florofordan ybarat.Tigirçiniň ýagty çeşmesi bilen tolgunanda, florofor floresan çykarýar.Mundan başga-da, zond 3′end-de söndürijiden durýar.Habarçy geniniň söndürijä ýakynlygy floresanlygyň ýüze çykmagynyň öňüni alýar.

Giňeldiş ädiminde DNK polimeraza täze seti sintez edýär.Polimeraza TaqMan zondyna ýetende, onuň endogen 5 ′ ýadro işjeňligi, boýagy söndürijiden bölüp, zondy ýapýar.

PCR-iň her sikli bilen has köp boýag molekulalary bölünip çykýar, netijede sintez edilen amplikonlaryň sanyna proporsional floresan intensiwligi ýokarlanýar.

Bu usul, nusgada bar bolan yzygiderliligiň sanyny hasaplamaga mümkinçilik berýär.Iki aýlawly DNK bölekleriniň sany her siklde iki esse köpelýär.Şonuň üçin PCR gaty kiçi nusgalary seljermek üçin ulanylyp bilner.

Floresan signaly ölçemek üçin wolfram halogen çyrasy, tolgundyryjy süzgüç, reflektor, obýektiw, zyňyndy süzgüji we enjam bilen ulanylýan CCD kamerasy zarýad berilýär.

4-nji ädim

Floresan signaly ölçemek üçin wolfram halogen çyrasy, tolgundyryjy süzgüç, reflektor, obýektiw, zyňyndy süzgüji we enjam bilen ulanylýan CCD kamerasy zarýad berilýär.

Çyradan süzülen yşyk reflektor bilen şöhlelenýär, kondensator linzasyndan geçýär we her deşikiň merkezine gönükdirilýär.Soňra deşikden çykýan floresan aýnadan şöhlelenýär, zyňyndy süzgüçinden geçýär we KCD kamerasy tarapyndan kesgitlenýär.Her PCR siklinde, öz-özüni tolgundyrýan florofor yşygy KCD tarapyndan kesgitlenip bilner.

Alnan ýagtylygy sanly maglumatlara öwürýär.Bu usula real wagt PCR diýilýär we PCR reaksiýasynyň gidişine real wagt gözegçilik etmäge mümkinçilik berýär.