PCR (polimeraza zynjyr reaksiýasy), 30 ýyldan gowrak taryhy bolan in vitro DNK güýçlendirmek tehnologiýalarynyň biridir.

PCR tehnologiýasy 1983-nji ýylda ABŞ-nyň Cetus şäherinden Kary Mullis tarapyndan öňe sürüldi. Mullis 1985-nji ýylda PCR patentine ýüz tutdy we şol ýyl Ylym boýunça ilkinji PCR akademiki işini neşir etdi.Mullis işi üçin 1993-nji ýylda himiýa boýunça Nobel baýragyna eýe bolupdy.

PCR-iň esasy ýörelgeleri

PCR maksatly DNK böleklerini bir milliondan gowrak güýçlendirip biler.Principleörelge, DNK polimerazynyň katalizinde, esasy DNK-ny şablon we giňeltmegiň başlangyç nokady hökmünde kesgitli başlangyç hökmünde ulanýar.Witroda denaturasiýa, annealing we giňeltmek ýaly ädimler arkaly köpeldilýär.Gyz süýümli DNK prosesi ene-atanyň şablon DNK-synyň üstüni ýetirýär.

Adaty PCR prosesi üç basgançaga bölünýär:

1.Denaturasiýa: DNK goşa setirleri bölmek üçin ýokary temperaturany ulanyň.DNK goşa zolaklaryň arasyndaky wodorod baglanyşygy ýokary temperaturada (93-98 ℃) bozulýar.

2.Annealing: Iki hatar DNK bölünenden soň, primer bir hatar DNK bilen baglanyşyp biler ýaly temperaturany peseldiň.

3.Goşma: DNK polimeraza, temperatura peselende baglanan primerlerden DNK zolaklary boýunça goşmaça setirleri sintez edip başlaýar.Giňeldiş tamamlanandan soň, bir sikl tamamlanýar we DNK bölekleriniň sany iki esse köpelýär

Bu üç ädimi 25-35 gezek gaýtalap, DNK bölekleriniň sany çalt artar.

PCR-iň ugurtapyjylygy, dürli primerleriň dürli maksatly genler üçin döredilip bilinmegi, maksatly gen bölekleriniň gysga wagtyň içinde güýçlendirilmegi üçin.

Şu wagta çenli PCR-ni üç kategoriýa bölmek bolar, ýagny adaty PCR, floresan mukdar PCR we sanly PCR.

Ordinaryönekeý PCR-iň birinji nesli

Maksatly geni güýçlendirmek üçin adaty PCR güýçlendiriji guralyny ulanyň we önümi anyklamak üçin agarose gel elektroforezini ulanyň, diňe hil derňewi edilip bilner.

Birinji nesil PCR-iň esasy kemçilikleri:

1. specificörite däl güýçlendirme we ýalan oňyn netijelere ýykgyn ediň.

2. ectionüze çykarmak köp wagt alýar we amal kyn.

3. Diňe hil taýdan synag edilip bilner

Ikinji nesil Real-Wagt PCR

Real wagt PCR, qPCR diýlip hem atlandyrylýar, reaksiýa ulgamynyň gidişini görkezip bilýän floresan zondlary ulanýar we floresan signallaryň toplanmagy arkaly güýçlendirilen önümleriň ýygnanmagyna gözegçilik edýär we netijelere floresan egrisi arkaly baha berýär.Cq bahasynyň we adaty egriniň kömegi bilen bahalandyrylyp bilner.

QPCR tehnologiýasy ýapyk ulgamda amala aşyrylýandygy sebäpli, hapalanmak ähtimallygy azalýar we mukdar taýdan kesgitlemek üçin floresan signalyna gözegçilik edilip bilner, şonuň üçin kliniki tejribede iň giňden ulanylýar we PCR-de agdyklyk edýän tehnologiýa öwrüldi.

Hakyky floresan mukdar PCR-de ulanylýan floresan maddalary: TaqMan floresan zondy, molekulýar maýaklar we floresan boýag.

1) TaqMan floresan zondy:

PCR güýçlendirilende, bir jübüt primer goşulanda belli bir floresan zond goşulýar.Synag oligonukleotid bolup, iki ujuna habarçy floresan topary we söndüriji floresan topary diýilýär.

Synag üýtgemänsoň, habarçy topary tarapyndan çykýan floresan signal söndüriji topar tarapyndan sorulýar;PCR güýçlendirilende, Taq fermentiniň 5′-3 ′ ekzonukleýasiýa işjeňligi barlagy ýapýar we peseldýär, habarçy floresan topary we söndüriji bolýar

2) SYBR floresan boýag:

PCR reaksiýa ulgamynda artykmaç SYBR floresan boýag goşulýar.SYBR floresan boýagy DNK goşa hatara ýörite goşulmansoň, floresan signal çykarýar.Zynjyryň içine girmedik SYBR boýag molekulasy hiç hili floresan signal çykarmaz we şeýlelik bilen floresan signalyny üpjün eder PCR önümleriniň köpelmegi PCR önümleriniň köpelmegi bilen doly sinhronlanýar.SYBR diňe iki hatar DNK bilen baglanyşýar, şonuň üçin ereýän egri PCR reaksiýasynyň aýratynlygyny ýa-da ýokdugyny kesgitlemek üçin ulanylyp bilner.

3) Molekulýar maýak:

Iki we 5 belgili oligonukleotid zondy, 5 we 3 ujunda takmynan 8 bazadan ybarat saç düzümini emele getirýär.Iki ujundaky nuklein kislotasynyň yzygiderliligi biri-biri bilen jübütlenip, floresan toparynyň we söndüriji toparyň berk bolmagyna sebäp bolýar.Closeakyn, hiç hili floresan öndürilmez.

PCR önümi döredilenden soň, anneasiýa prosesinde molekulýar maýagyň orta bölegi belli bir DNK yzygiderliligi bilen jübütlenýär we floresan geni floresan öndürmek üçin söndüriji gen bilen bölünýär.

Ikinji nesil PCR-iň esasy kemçilikleri:

Duýgurlyk henizem ýetmezçilik edýär we pes göçürme nusgalarynyň tapylmagy nädogry.

Fon bahasynyň täsiri bar we netijede päsgelçilik döreýär.

Reaksiýa ulgamynda PCR inhibitorlary bar bolsa, ýüze çykaryş netijeleri päsgelçiliklere sezewar bolýar.

Üçünji nesil sanly PCR

Sanly PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ahyrky yzygiderliligi kesgitlemek arkaly maksat yzygiderliliginiň göçürme sanyny hasaplaýar we içerki gözegçilikleri we adaty egrileri ulanman takyk mukdar taýdan kesgitlemäni ýerine ýetirip biler.

Sanly PCR ahyrky nokady kesgitlemegi ulanýar we Ct bahasyna (sikl bosagasyna) bagly däl, şonuň üçin sanly PCR reaksiýasy güýçlendirme netijeliligine az täsir edýär we ýokary reaksiýa we köpelmek bilen PCR reaksiýa inhibitorlaryna çydamlylygy ýokarlanýar.

Highokary duýgurlygyň we ýokary takyklygyň aýratynlyklary sebäpli PCR reaksiýa ingibitorlary aňsatlyk bilen päsgel bermeýär we gözleg we amaly nokadyna öwrülen adaty önümler bolmazdan hakyky mutlak mukdary gazanyp biler.

Reaksiýa bölüminiň dürli görnüşlerine görä, ony üç esasy görnüşe bölmek bolar: mikrofliid, çip we damja ulgamlary.

1) Mikrofliid sanly PCR, mdPCR:

Mikrofliid tehnologiýasyna esaslanyp, DNK şablony bölünýär.Mikrofliid tehnologiýasy nano-kämilleşdiriş nusgasyny ýa-da kiçi damjalaryň emele gelmegini amala aşyryp biler, ýöne damjalara ýörite adsorbsion usuly gerek we soňra PCR reaksiýa ulgamy bilen birleşdirilýär.mdPCR çalyşmagyň beýleki usullary bilen kem-kemden kabul edildi.

2) Damja esasly sanly PCR, ddPCR:

Nusgany damjalara gaýtadan işlemek üçin suwda ýagly damja öndürmek tehnologiýasyny ulanyň we nuklein kislotasynyň molekulalaryny öz içine alýan reaksiýa ulgamyny müňlerçe nanoskale damjalaryna bölüň, olaryň hersinde ýüze çykaryljak nuklein kislotasynyň maksat molekulasy ýok ýa-da synagdan geçirilmeli bir ýa-da birnäçe nuklein kislotasynyň maksatly molekulalary bar.

3) Çip esasly sanly PCR, cdPCR:

Silikon wafli ýa-da kwars aýnasynda köp mikrotublary we mikrokawitleri oýmak üçin toplumlaýyn suwuklyk tehnologiýasyndan peýdalanyň we erginiň akymyny dürli gözegçilik klapanlary arkaly dolandyryň we mutlak mukdaryny gazanmak üçin sanly suwuklygy reaksiýa guýularyna deň ölçegdäki nanometrlere bölüň.

Üçünji nesil PCR-iň esasy kemçilikleri:

Enjamlar we reagentler gymmat.

Şablonyň hil talaplary ýokary.Şablonyň mukdary mikrosistemanyň mukdaryndan ýokary bolsa, hasaplamak mümkin bolmaz we gaty az bolsa, mukdar takyklygy peseler.

Specificörite güýçlendirme bolanda ýalan pozitiwler hem döredilip bilner.