PCR, köp PCR, PCR ýagdaýynda, Ters PCR, RT-PCR, qPCR （1）-PCR

Dürli PCR düşünjelerini, ädimlerini we jikme-jikliklerini düzeris

Ⅰ. PCR

PCR diýlip atlandyrylýan polimeraza zynjyr reaksiýasy, belli bir DNK böleklerini ulaltmak üçin ulanylýan molekulýar biologiki tehnologiýadyr.Witroda ýörite DNK köpeltmek hökmünde kabul edip bolar.DNK polimeraza (DNK polimeraza I) 1955-nji ýylda, eksperimental gymmaty we amaly ähmiýeti bolan E.Koliniň Klenow bölegi 1970-nji ýyllaryň başynda doktor H. Klenow tarapyndan açyldy, ýöne bu ferment temperatura çydamly däldigi sebäpli ýokary temperatura peselip biler, şonuň üçin polimeraza zynjyryň ýokary temperaturanyň peselmegi bilen jogap bermeýär.Häzirki wagtda ulanylýan fermentler (Taq polimeraza diýilýär) 1976-njy ýylda yssy bahar bakteriýasy bolan Termus suwundan izolirlendi. Onuň häsiýetnamasy ýokary temperatura garşy durup biljekdigi we ideal ferment bolmagy, ýöne 1980-nji ýyllardan soň giňden ulanylmagydyr.PCR-iň asyl başlangyç prototipiniň asyl düşünjesi, doktor KJell Kleppe tarapyndan 1971-nji ýylda teklip edilen geni bejermek we göçürmek bilen meňzeýär. Ilkinji ýönekeý we gysga möhletli gen nusgasyny neşir etdi (PCR-iň ilkinji iki sikl reaksiýasyna meňzeýär).Häzirki wagtda işlenip düzülen PCR doktor Kary B. Mullis tarapyndan 1983-nji ýylda işlenip düzüldi. Doktor Mullis şol ýyl PE kompaniýalaryna hyzmat etdi, şonuň üçin PE PCR pudagynda aýratyn statusa eýe.Doktor Mullis Saiki we beýlekiler bilen ilkinji baglanyşykly kagyzy 1985-nji ýylda resmi taýdan neşir etdi. Şondan bäri PCR-iň ulanylmagy günde müňlerçe kilometre barabardyr we degişli resminamalaryň hilini başga-da köp gözleg usullaryny oňaýsyz edip biler.Netijede, PCR tehnologiýasy biologiki ylmy gözleglerde we kliniki goşundylarda giňden ulanylýar we molekulýar biologiýa gözlegleriniň iň möhüm tehnologiýasyna öwrüldi.Şeýle hem Mullis 1993-nji ýylda himiýa boýunça Nobel baýragyny aldy.

PCRIpleörelge

PCR tehnologiýasynyň esasy ýörelgesi, DNK-nyň tebigy köpeltmek prosesine meňzeýär we onuň aýratynlygy maksat yzygiderliliginiň iki ujuny doldurýan oligonukleotid primerine baglydyr.PCR degenerasiýa-uzaldyjy üç esasy reaksiýa ädiminden durýar: temp Şablonyň DNK-synyň emele gelmegi: Şablon DNK belli bir wagt üçin takmynan 93 ° C gyzdyrylandan soň, DNK-nyň şablonynyň PCR güýçlendirilmegi netijesinde emele gelen goşa zynjyrly DNK üçin goşa DNK çözgüdi, ony indiki tegelek reaksiýa üçin birleşdirip biler.A Şablon DNK-nyň we birleşdirijiniň (birleşmesi): Şablon DNK gyzdyrylyp, bir zynjyrda zaýalanandan soň, temperatura 55 ° C töweregi peselýär.Astaryň goşmaça yzygiderliligi we DNK bir zynjyrly şablon.Prim Astaryň uzalmagy: DNK şablony - deslapky baglanyşyk TaqDNA polimerazynyň hereketine esaslanýar, reaksiýa çig mal hökmünde dNTP bilen.Göçürmek ýörelgesini saklaň, şablon DNK zynjyrynyň üstüni ýetirýän täze ýarym ätiýaçlandyrylan nusga zynjyryny sintez ediň we sikliň degenerasiýa-anneal-uzaldyş üç prosesi has köp “ýarym ätiýaçlandyrylan nusga zynjyryny” alyp biler we bu täze zynjyr ýene-de elýeterli bolar. Indiki aýlaw üçin şablon boluň.Aýlawy tamamlamak üçin 2-4 minut gerek, maksatly gen 2-3 sagadyň içinde birnäçe million gezek güýçlendirilip bilner.

StandartPCRReaksiýa ulgamy

PCR reaksiýasynyň bäş elementi

PCR reaksiýasyna esasan bäş görnüşli maddalar bar, ýagny primer, ferment, dNTP, şablon we bufer (Mg2 + zerur).[PCR prosedurasy]

Adaty PCR prosesi üç basgançaga bölünýär

1. DNK degenerasiýasy (90 ° C-96 ° C): malylylyk hereketinde iki zynjyrly DNK şablonlary, wodorod baglanyşyklary döwülýär we bir zynjyrly DNK emele gelýär.

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): Ulgamyň temperaturasy peselýär, primer DNK şablony bilen birleşdirilip, ýerli goşa zynjyr emele getirýär.

3. Giňeldiş (70 ℃ -75 ℃): Tak fermentiniň (takmynan 72 ° C, iň oňat işjeňlik) täsiri astynda, DNTP çig mal hökmünde ulanylýar, primeriň → 3 ′ ujundan 5 ′ ujuna çenli uzalýar, sintez we şablon biri-biriniň DNK zynjyryny doldurýar.

Her sikl denatirlenýär, dykylýar we uzalýar, DNK-nyň mukdaryny iki esse köpeldýär.Häzirki wagtda güýçlendiriş meýdanynyň gysga bolmagy sebäpli, käbir PCR, tak ferment işjeňligi iň amatly bolmasa-da, gysga wagtyň içinde köpeldilip bilner, şonuň üçin ony iki basgançaga üýtgedip bolar, ýagny bir wagtyň özünde 60 ° C-65 ° C derejesinde ýerine ýetirip bolýar.Götermek we sowatmak prosesini azaltmak we jogap tizligini ýokarlandyrmak üçin.

PCR reaksiýa aýratynlyklary

● -okary aýratynlyk

PCR jogabynyň kesgitli aýgytlaýjy faktorlary şulardyr: prim Primeriň we şablonyň DNK-nyň aýratyn utgaşmasy.Base Esasy jübütlemek ýörelgesi.Ta TaqDNA polimeraza sintez reaksiýasynyň wepalylygy.Target Maksat geniniň aýratynlygy we konserwatiwligi.

Astarlaryň we şablonlaryň dogry utgaşmasy esasydyr.Astaryň we şablonyň baglanyşygy we asma zynjyryň uzalmagy aşgar bazanyň gabat gelmegi ýörelgesine esaslanýar.Polimeraza sintez reaksiýalarynyň wepalylygy we reaksiýada şablonyň we primeriň baglanyşygyny (birleşmesini) etmek üçin Taq DNK polimerazynyň ýokary temperatura garşylygy has ýokary temperaturada amala aşyrylyp bilner.Kombinasiýanyň aýratynlygy ep-esli ýokarlanýar.Klip ýokary derejede dogrylygy saklap biler.Consokary konserwatiw we ýokary konserwatiwligi bolan maksatly genetiki sebiti saýlamak bilen, onuň aýratynlygy has ýokarydyr.

● Sokary duýgurlyk

PCR önümleriniň önümçilik mukdary mikrokontrolaryň derejesini mikrogramma (μg = -6) derejesine çenli ýokarlandyrmak üçin Picker (PG = 10-12) başlangyç şablonyny giňeldip biljek indeks bilen ýokarlanýar.Maksatly öýjükleri 1 million öýjükden tapyp bolýar;wiruslary ýüze çykarmakda PCR-iň duýgurlygy 3 RFU-a (boş ýerler emele gelen birlikler) ýetip biler;bakteriýa ylmynda iň pes kesgitleme derejesi 3 bakteriýa.

● pleönekeý we çalt

PCR şöhlelenmesi ýokary temperaturaly Taq DNK polimerazyny ulanýar, bu bir wagtyň özünde reaksiýa çözgüdini goşýar, ýagny DNK güýçlendiriji ergininde we suw hammamynda degenerasiýa-anne-uzalma reaksiýasy.Adatça güýçlendirme reaksiýasy 2-den 4 sagada çenli tamamlanýar.Giňeldilen önümler, adatça, elektrik gylyjy bilen derňelýär we izotoplary ulanmaly däl, radioaktiw hapalanma we aňsat mahabatlandyrma.

Spec Nusganyň arassalygy pes

Wiruslary ýa-da bakteriýalary we medeniýet öýjüklerini aýyrmagyň zerurlygy ýok.Güýçlendiriji hökmünde DNK çig önümleri we RNK ulanylyp bilner.DNK güýçlendirmek kesgitlemesi, gan, beden suwuklygy, üsgülewük ýuwujy suwuklyk, saç, öýjükler we janly dokuma ýaly kliniki nusgalary ulanmak arkaly gönüden-göni ulanylyp bilner.

PCRumumy meseleler

Negative sealňyş negatiw, güýçlendirilen zolak ýok

PCR reaksiýasynyň esasy tapgyrlary: temp şablon nuklein kislotalaryny taýýarlamak, prim primerleriň hili we aýratynlygy, fermentleriň hili ④ PCR sikl şertleri.Sebäbini tapmak hem ýokardaky baglanyşyklar üçin derňelmeli we öwrenilmeli.

Şablonlar: ① Şablonda dürli belok bar, template Şablonda Taq ferment inhibitory bar, the Şablondaky belok ýok edilmeýär, esasanam hromosomadaky topar belogy.N Deminer nuklein kislotasynyň degenerasiýasy düýpli däl.Fermentleriň we primerleriň hili gowy bolanda, güýçlendiriji zolak ýok, bu, mysal üçin iýmit siňdiriş bejergisi bolmagy ähtimal.Şablonyň nuklein kislotasyny çykarmak prosesinde nädogry bir zat bar, şonuň üçin iýmit siňdirişiň täsirli we durnukly çözgüdini taýýarlamak üçin prosedurasy kesgitlenmeli we esassyz üýtgedilmeli däl.

Fermentleriň hereketsiz bolmagy: ferment işjeňliginiň ýitirilendigini ýa-da ýeterlik däldigini seljermek üçin täze ferment ýa-da köne we täze fermentler bilelikde ulanylmaly, ýalan negatiwlere sebäp bolýar.Tak fermentiniň ýa-da etidium bromidiniň käwagt ýatdan çykarylýandygyny bellemelidiris.

Primer: primeriň hili, primeriň konsentrasiýasy we iki primeriň konsentrasiýasy simmetrikmi.PCR şowsuzlygynyň ýa-da köpelýän zolagyň ideal däl we ýaýramaga ýykgyn etmeginiň umumy sebäbi.Käbir partiýa sanlarynyň desgalarynyň hili bilen baglanyşykly meseleler bar.Iki desganyň ýokary konsentrasiýasy we pes konsentrasiýasy bar, pes netijelilik asimmetrik güýçlendirilmegine sebäp bolýar.Garşylyk çäreleri: units Bölümleri sintez etmek üçin gowy primeri saýlaň.Prim Astaryň konsentrasiýasy diňe bir OD bahasyna bagly bolman, agar şeker jeli elektroforezi etmek üçin primeriň asyl suwuklygyna hem üns berýär.Astar zolak zolagy bolmaly we iki primeriň ýagtylygy umuman yzygiderli bolmaly.Guşak, PCR bu wagt şowsuz bolup biler we başlangyç sintez bölümi bilen çözülmelidir.Astar ýokary bolsa, ýagtylygy pes we suwuklandyrylanda konsentrasiýasy deňagramly bolmaly.Prim Astaryň ýaramazlaşmagyna we peselmegine sebäp boljak sowadyjynyň köp doňmagynyň ýa-da uzak möhletli sowadyjy bölekleriniň öňüni almak üçin primer tölenmeli we ýokary konsentrasiýada saklanmalydyr.Prim Astaryň dizaýny esassyz, meselem, asmanyň uzynlygy ýeterlik däl, we primerleriň arasynda di klaster emele gelýär.

Mg2 + konsentrasiýasy: Mg2 + ion konsentrasiýasy PCR güýçlendirmek netijeliligine uly täsir edýär.Artykmaç konsentrasiýa PCR güýçlendirme garşy jynsyny azaldyp biler.Konsentrasiýa gaty pes bolsa, PCR güýçlendirme çykyşy hatda giňeltmek zolagy bolmazdan PCR güýçlendirme şowsuzlygyny döreder.

Reaksiýanyň göwrüminiň üýtgemegi: PCR güýçlendirmekde ulanylýan ses 20ul, 30ul, 50ul ýa-da 100uL, PCR güýçlendirmek üçin ýüz tutmanyň köp mukdary ylmy gözlegleriň we kliniki synaglaryň dürli maksatlaryna laýyklykda kesgitlenýär.20ul ýaly kiçi göwrümleri ýasanyňyzdan soň, ululygy düzülende şnur ýagdaýy düzmeli, ýogsam şowsuz bolar.

Fiziki sebäpler: PCR güýçlendirmek üçin özgerişlik gaty möhümdir.Eger degenerasiýa temperaturasy pes bolsa, degenerasiýa wagty gysga bolsa, ýalan negatiwlerde ýüze çykmagy ähtimal;gaty pes gyzdyryjy temperatura, ýörite däl güýçlendirilmegine sebäp bolup biler we güýçlendirmek netijeliligini peseldip biler.PCR güýçlendirmek netijeliligini peseltmek üçin primerleriň we şablonlaryň birleşmesine ýokary täsir edýär.Käwagt PCR-iň şowsuzlygynyň sebäplerinden biri bolan uzaldyjyda ýa-da suwda ereýän ojakda üýtgeýänligi, gyzdyrýan we uzaldylan temperaturany kesgitlemek üçin adaty termometrleri ulanmak zerur bolýar.

Maksat yzygiderliliginiň wariantlary: Maksat yzygiderliligi ýüze çyksa, mutasiýa ýa-da öçürilse, prototip bilen şablonyň utgaşmasy birleşdirilse ýa-da maksat yzygiderliliginiň ýoklugy sebäpli primer we şablon goşmaça yzygiderliligi ýitirer we PCR güýçlendirilmegi üstünlikli bolmaz.

Sealňyş polo positiveitel

PCR güýçlendiriji zolagy maksat yzygiderliligi zolagyna laýyk gelýär we käwagt onuň zolagy has arassa we has ýokary bolýar.

Esasy dizaýn laýyk däl: saýlanan güýçlendirme yzygiderliligi we maksatly güýçlendirme yzygiderliligi birmeňzeşdir, şonuň üçin PCR güýçlendirilende, güýçlendirilen PCR önümleri maksatly däl yzygiderlilikdir.Maksat yzygiderliligi gaty gysga ýa-da primer gaty gysga we ýalňyş polo positiveitel bolýar.Täzeden düzülmeli.

Maksat yzygiderliliginiň ýa-da güýçlendiriji önümleriň haç hapalanmagy: Bu hapalanmagyň iki sebäbi bar: Birinjiden, ähli genomyň ýa-da uly segmentleriň kesişmegi, ýalan pozitiwlere sebäp bolýar.Falsealan polo positiveiteliň bu görnüşini aşakdaky usullar bilen çözüp bolar: Maksat yzygiderliliginiň nusga ýaragyna dem almazlygy ýa-da merkezden gaçyryş turbasyndan çykmagy üçin seresap we mylaýym boluň.Highokary temperatura çydap bilmeýän fermentlerden we maddalardan başga ähli reagentler ýa-da enjamlar ýokary basyş bilen dezinfeksiýa edilmelidir.Merkezden gaçyryş turbalary we nusgalary bir gezekde ulanylmaly.Zerur bolanda, nusgalary goşmazdan ozal, bar bolan nuklein kislotasyny ýok etmek üçin reaksiýa turbasy we reagent ultramelewşe şöhlelerine sezewar bolýar.Ikinjiden, howanyň hapalanmagynda ownuk bölekler.Bu ownuk bölekler maksat yzygiderliliginden has gysga, ýöne belli bir gomologiýa bar.Biri-birine bölüp bolýar.Astarlary doldurandan soň, ýalan polo positiveitel önümçilige sebäp boljak PCR önümi giňeldilip bilner.Höwürtge PCR usulyny azaltmak ýa-da ýok etmek üçin ulanylyp bilner.

N Belli däl güýçlendiriji zolagy peýda boluň

PCR güýçlendirilenden soň peýda bolan zolaklar garaşylýan ululyga, ýa-da uly ýa-da kiçi, ýa-da şol bir wagtyň özünde ýa-da şol bir wagtyň özünde ýörite güýçlendiriji zolaklara we ýörite däl güýçlendirme zolaklaryna laýyk gelmeýär.Aýratyn däl zolaklaryň ýüze çykmagy: Birinjiden, desgalar maksat yzygiderliligine doly däl ýa-da di klasterini emele getirmek üçin primeriň polimerizasiýasydyr.Ikinjisi, MG2 + ionlarynyň konsentrasiýasynyň aşa ýokary bolmagy, gyzdyrmagyň temperaturasy gaty pes we PCR siklleriniň sany bilen baglanyşykly.Ikinjiden, fermentleriň hili we mukdary.Köplenç käbir çeşmeleriň fermentleri ýörite däl zolaklara ýykgyn edýärler we beýleki çeşmäniň fermentleri ýüze çykmaýar.Käwagt fermentleriň ýörite däl güýçlendirilmegi hem ýüze çykýar.Garşylyk çäreleri: zerur bolsa täzeden özüne çekiji.Fermentiň mukdaryny azaltmak ýa-da başga bir çeşmäniň fermentini çalyşmak.Başlangyç mukdaryny azaltmak, şablonlaryň mukdaryny köpeltmek we aýlawlaryň sanyny azaltmak.Anne temperaturasyny dogry ýokarlandyryň ýa-da iki temperatura nokady usulyny ulanyň (93 ° C degenerasiýa, anneal we takmynan 65 ° C çenli uzalýar).

Ak Çeňňek polotensany ýa-da lentany peýda boluň

PCR güýçlendirmek käwagt ulanylýan ýa-da gabykly ýa-da haly ýaly guşak ýaly bolup görünýär.Şol sebäpden, fermentleriň aşa köp bolmagy ýa-da fermentiň hiliniň pesligi sebäpli, DNTP konsentrasiýasy gaty ýokary, Mg2 + konsentrasiýasy gaty ýokary, anne temperaturasy gaty pes we siklleriň sany gaty köp.Garşylyk çäreleri: - Fermentleriň mukdaryny azaltmak ýa-da başga bir çeşmäniň fermentini üýtgetmek.D DNTP konsentrasiýasyny azaltmak M Mg2 + konsentrasiýasyny dogry azaldyň.Temp Şablonlaryň mukdaryny köpeltmek we aýlawlaryň sanyny azaltmak.

Degişli önümler

PCR Gahrymany (Boýag bilen)

◮ Has ýokary wepalylyk: adaty Taq fermentinden 6 esse;

Aster Güýçlendirmek tizligi

◮ Has köp şablon uýgunlaşma

Her Has ýokary güýçlendirme netijeliligi

◮ Daşky gurşawa çydamlylyk has güýçlidir: bir hepdäniň dowamynda 37 ° C derejesinde, 90% -den gowrak işjeňligi dowam etdirýär;

◮ Onda 5 '→ 3' DNK polimeraza işjeňligi we 3 '→ 5' ekzonukleý işjeňligi bolmazdan, 5 '→ 3' ekzonukleýasiýa işjeňligi bar.

PCR Easyᵀᴹ (Boýag bilen)

Üýtgeşik reaksiýa ulgamy we ýokary netijelilik Taq DNK polimeraza PCR reaksiýasyny güýçlendirmek netijeliligini, aýratynlygyny we duýgurlygyny ýokarlandyrýar.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Bir ädim) -SYBR Green I.

◮ Bir basgançakly toplum ters transkripsiýany we qPCR bir turbada iki reaksiýa döredýär, diňe şablon RNA, ýörite PCR primerleri we RNase-Free ddH goşmaly₂O.

Kit Kitap wirusly RNK-ny çalt we täsirli mukdarda analiz edip biler ýa-da RNK-ny yzarlap biler.

Kit Toplumda täsin “Foregene” ters transkripsiýa reagenti we “Foregene HotStar Taq DNA polimeraza” ulanylýar, reaksiýanyň güýçlendirme netijeliligini we aýratynlygyny netijeli ýokarlandyrmak üçin özboluşly reaksiýa ulgamy bilen birleşdirilýär.

Optimal Optimallaşdyrylan reaksiýa ulgamy reaksiýany has ýokary duýgurlyga, ýylylyk durnuklylygyna we has oňat çydamlylyga eýe edýär.

◮ RT-qPCR aňsat^TM.

RT aňsat^TMII (Master Premix üçin üçin birinji hatar cDNA sinteziReal Time PCR)

- 2 minutyň içinde şablondaky gDNA-ny aýryp bilýän gDNA-ny aýyrmak üçin ýeterlik ukyp.

- Netijeli ters transkripsiýa ulgamy, birinji setir CDNA-nyň sintezini tamamlamak üçin bary-ýogy 15 minut gerek.

-Kompleks şablonlar: ýokary GC mazmuny we çylşyrymly ikinji derejeli gurluşly şablonlar hem ýokary netijelilik bilen tersine bolup biler.

- highokary duýgurlyk ters transkripsiýa ulgamy, pg derejeli şablonlar hem ýokary hilli cDNA alyp bilerler.

- Tersine transkripsiýa ulgamy ýokary ýylylyk durnuklylygyna, iň amatly reaksiýa temperaturasyna 42 is, henizem 50 at derejesinde ters transkripsiýa ýerine ýetirijiligine eýe.