Ct bahasy, floresan mukdar PCR-iň iň möhüm netije görkeziş görnüşidir.Gen aňlatma tapawudyny ýa-da gen nusgasynyň sanyny hasaplamak üçin ulanylýar.Onda ýerlikli hasaplanýan floresan mukdarynyň Ct bahasy nämeden ybarat?Ct bahasynyň täsirli diapazonyny nädip üpjün etmeli?
Ct bahasy näme?
QPCR güýçlendirme prosesi wagtynda güýçlendirilen önümiň floresan signaly kesgitlenen floresan çägine ýetende degişli mukdarda güýçlendirme siklleri (Sikl Threshold).C sikl, T bolsa Threshold diýmekdir.Plyönekeý söz bilen aýdylanda, Ct bahasy başlangyç şablon güýçlendirilmegi qPCR-de önümiň belli bir mukdaryna ýetende gabat gelýän siklleriň sanydyr.“Belli bir mukdarda önüm” diýilýän zat soňrak düşündiriler.
Ct bahasy näme edýär?
1. Eksonensial güýçlendirme, şablon mukdary we Ct bahasynyň arasyndaky baglanyşyk
Iň gowusy, qPCR-de genler belli bir siklden soň ekspensial güýçlendirme arkaly ýygnanýar.Güýçlendirme siklleriniň sany bilen önümleriň mukdarynyň arasyndaky baglanyşyk: Güýçlendirilen önümiň mukdary = başlangyç şablonyň mukdary × (1 + En) sikl sany.Şeýle-de bolsa, qPCR reaksiýasy elmydama ideal ýagdaýda däl.Güýçlendirilen önümiň mukdary “belli bir önümiň mukdaryna” ýetende, bu döwürde siklleriň sany Ct bahasy bolup, ekspensial güýçlendirme döwründe bolýar.Ct bahasy bilen başlangyç şablonyň mukdary arasyndaky baglanyşyk: Şablonyň Ct bahasy bilen şablonyň başlangyç göçürme belgisiniň logarifminiň arasynda çyzykly baglanyşyk bar.Başlangyç şablonyň konsentrasiýasy näçe ýokary bolsa, Ct bahasy şonça-da kiçi bolar;başlangyç şablonyň konsentrasiýasy näçe pes bolsa, Ct bahasy şonça-da ulydyr.
2. Güýçlendirmek egrisi, floresan çäkleri we belli bir PCR önüm mukdary
QPCR güýçlendirme önüminiň mukdary gönüden-göni floresan signal görnüşinde, ýagny güýçlendirme egrisi görnüşinde görkezilýär.PCR-iň başlangyç döwründe güýçlendirme ideal şertlerde bolýar, siklleriň sany az, önümiň toplanmagy az we floresan derejesini floresan fonundan anyk tapawutlandyryp bolmaz.Şondan soň floresan ýokarlanýar we ekspensial faza girýär.PCR önüminiň mukdary, “belli bir mukdarda önüm” hökmünde ulanylyp bilinjek ekspensial fazada bolanda kesgitlenip bilner we şablonyň başlangyç mazmuny şundan çykarylyp bilner.Şonuň üçin belli bir önüme gabat gelýän floresan signalyň intensiwligi floresan çägidir.
PCR-iň giçki döwründe güýçlendirme egrisi ekspensial güýçlendirmäni görkezmeýär we çyzykly faza we plato fazasyna girýär.
3. Ct bahalarynyň öndürijiligi
PCR sikli Ct bahasynyň sikl sanyna ýetende, hakyky ekspensial güýçlendirme döwrüne girdi.Bu wagt kiçi ýalňyşlyk güýçlendirilmedi, şonuň üçin Ct bahasynyň köpelmegi gaty gowy, ýagny şol bir şablon dürli wagtda ýa-da dürli turbalarda bir wagtda güýçlendirilýär.Güýçlendirmek, alnan Ct bahasy hemişelikdir.
1. Güýçlendirmek netijeliligi En
PCR güýçlendirmek netijeliligi polimerazyň geni amplikona öwürýän netijeliligini aňladýar.Bir DNK molekulasy iki DNK molekulasyna öwrülende güýçlendirme netijeliligi 100% bolýar.Güýçlendirmek netijeliligi köplenç En görnüşinde aňladylýar.Soňky makalalaryň derňewini aňsatlaşdyrmak üçin güýçlendirmek netijeliligine täsir edýän faktorlar gysgaça girizilýär.
| Täsir ediji faktorlar | düşündiriş | Nädip höküm etmeli? |
| A. PCR ingibitorlary | 1. Şablon DNK-da beloklar ýa-da ýuwujy serişdeler ýaly PCR reaksiýasyny saklaýan maddalar bar.2. Ters transkripsiýadan soň CDNA şablon RNK ýa-da RT reagent komponentleriniň ýokary konsentrasiýasyny öz içine alýar, bu soňraky PCR reaksiýasyny hem saklap biler. | 1. Hapalanmagyň bardygyny ýa-da ýokdugyny A260 / A280 we A260 / A230 ýa-da RNK elektroforeziniň gatnaşygyny ölçemek arkaly kesgitläp bolýar.2. CDNA ters transkripsiýadan soň belli bir gatnaşyga görä suwuklandyrylýarmy. |
| B. Nädogry deslapky dizaýn | Astarlar täsirli däl | Astar ölçegleri ýa-da saç çyzgylary, gabat gelmeýän we käwagt içerki dizaýnlary barlaň. |
| C. Nädogry PCR reaksiýa programmasynyň dizaýny | 1. Astarlar täsirli garyşdyryp bilmeýärler2. DNK polimerazynyň ýeterlik goýberilmegi 3. Uzak möhletli ýokary temperaturaly DNK polimeraza işjeňligi azaldy | 1. Anne temperaturasy primeriň TM bahasyndan has ýokary2. Denaturasiýadan öňki wagt gaty gysga 3. Reaksiýa prosedurasynyň her tapgyrynyň wagty gaty uzyn |
| D. Reagentleriň ýa-da turba geçiriji ýalňyşlyklaryň ýeterlik garyşmagy | Reaksiýa ulgamynda PCR reaksiýa komponentleriniň ýerli konsentrasiýasy gaty ýokary ýa-da deň däl, netijede PCR güýçlendirilmeginiň ekspensial däl güýçlenmegine sebäp bolýar. | |
| E. Amplikonyň uzynlygy | Amplikonyň uzynlygy gaty uzyn, 300 at güýjünden geçýär we güýçlendirme netijeliligi pes | Amplikonyň uzynlygynyň 80-300bp aralygyndadygyny barlaň |
| F. qPCR reagentleriniň täsiri | Reagentdäki DNK polimerazynyň konsentrasiýasy pes ýa-da buferdäki ionlaryň konsentrasiýasy optimallaşdyrylmaýar, netijede Taq ferment işjeňligi iň ýokary derejä ýetmeýär | Güýçlendirmek netijeliligini standart egrilik bilen kesgitlemek |
2. Ct bahalarynyň diapazony
Ct bahalary 15-35 aralygynda.Ct bahasy 15-den pes bolsa, güýçlendirme başlangyç döwrüň çäginde we floresan çägine ýetmedik hasaplanýar.Iň gowusy, Ct bahasy bilen şablonyň başlangyç göçürme belgisiniň, ýagny adaty egriniň logarifminiň arasynda çyzykly baglanyşyk bar.Adaty egriniň üsti bilen, güýçlendirme netijeliligi 100% bolanda, geniň ýekeje göçürme sanyny kesgitlemek üçin hasaplanan Ct bahasy 35 töweregi bolýar. 35-den uly bolsa, şablonyň başlangyç göçürme sany teoretiki taýdan 1-den az bolup, manysyz hasap edilip bilner.
Dürli gen Ct diapazonlary üçin, gen göçürme sanynyň tapawudy we başlangyç şablon mukdaryndaky güýçlendirme netijeliligi sebäpli gen üçin standart egrilik etmeli we geniň çyzykly kesgitleme diapazonyny hasaplamaly.
3. Ct bahasynyň täsir ediji faktorlary
Güýçlendirme siklleriniň sany bilen önümiň mukdarynyň arasyndaky baglanyşykdan: güýçlendirilen önümiň mukdary = başlangyç şablonyň mukdary × (1 + En) sikl belgisi, ideal şertlerde başlangyç şablonyň we Eniň Ct bahasyna ýaramaz täsir etjekdigini görmek bolýar.Şablonyň hiliniň ýa-da güýçlendiriş netijeliliginiň tapawudy, Ct bahasynyň gaty uly ýa-da gaty kiçi bolmagyna sebäp bolar.
4.Ct bahasy gaty uly ýa-da gaty kiçi
Iş wagty: 22-2023-nji fewral
