Molekulýar diagnoz tehnologiýasy, keselleri çaklamak we anyklamak maksadyna ýetmek üçin adam bedeniniň we dürli patogenleriň genetiki materialynyň aňlatmasyny we gurluşyny kesgitlemek üçin molekulýar biologiýa usullaryny ulanýar.

Soňky ýyllarda molekulýar anyklaýyş tehnologiýasynyň kämilleşdirilmegi we gaýtalanmagy bilen molekulýar diagnostikanyň kliniki ulanylyşy has giň we çuňlaşdy we molekulýar diagnostika bazary çalt ösüş döwrüne gadam basdy.

Authorazyjy bazardaky umumy molekulýar anyklaýyş tehnologiýalaryny jemleýär we üç bölege bölünýär: birinji bölümi PCR tehnologiýasy, ikinji bölümi nuklein kislotasynyň izotermiki güýçlendiriş tehnologiýasy, ikinji bölümi yzygiderlilik tehnologiýasy bilen tanyşdyrýar.

01

I bölüm: PCR tehnologiýasy

PCR tehnologiýasy

PCR (polimeraza zynjyr reaksiýasy) 30 ýyldan gowrak taryhy bolan vitro DNK güýçlendirmek tehnologiýalarynyň biridir.

PCR tehnologiýasy 1983-nji ýylda ABŞ-nyň Cetus şäherinden Kary Mullis tarapyndan döredildi.Mullis 1985-nji ýylda PCR patenti üçin ýüz tutdy we şol ýylda Ylym boýunça ilkinji PCR akademiki işini neşir etdi.Mullis 1993-nji ýylda himiýa boýunça Nobel baýragyny aldy.

PCR-iň esasy ýörelgeleri

PCR maksatly DNK böleklerini bir milliondan gowrak güýçlendirip biler.Principleörelge, DNK polimerazynyň katalizlenmeginde esasy zolakly DNK şablon hökmünde, uzalmak üçin başlangyç nokat hökmünde belli bir primer ulanylýar.Witroda denaturasiýa, annealing we giňeltmek ýaly ädimler arkaly köpeldilýär.Gyz süýümli DNK prosesi ene-atanyň şablon DNK-synyň üstüni ýetirýär.

Adaty PCR prosesi üç basgançaga bölünýär:

1. Denaturasiýa: DNK goşa setirleri bölmek üçin ýokary temperaturany ulanyň.DNK goşa zolaklaryň arasyndaky wodorod baglanyşyklary ýokary temperaturada (93-98 ° C) bozulýar.

2. Annealing: Iki hatar DNK bölünenden soň, primer bir hatar DNK bilen baglanyşyp biler ýaly temperatura peselýär.

3. Giňeldiş: DNK polimeraza, temperatura peselende baglanan primerlerden DNK zolaklary boýunça goşmaça setirleri sintez edip başlaýar.Giňeldiş tamamlanandan soň, bir sikl tamamlanýar we DNK bölekleriniň sany iki esse köpelýär.

Bu üç ädimi 25-35 gezek gaýtalap, DNK bölekleriniň sany çalt artar.

PCR-iň ussatlygy, dürli primerleriň dürli maksatly genler üçin döredilip bilinmegi, maksatly gen bölekleriniň gysga wagtyň içinde güýçlendirilmegi üçin.

Şu wagta çenli PCR-ni üç kategoriýa bölmek bolar, ýagny adaty PCR, floresan mukdar PCR we sanly PCR.

Ordinaryönekeý PCR-iň birinji nesli

Maksatly geni güýçlendirmek üçin adaty PCR güýçlendiriji guralyny ulanyň we önümi anyklamak üçin agarose gel elektroforezini ulanyň, diňe hil derňewi edilip bilner.

Birinji nesil PCR-iň esasy kemçilikleri:

Specificörite däl güýçlendirme we ýalan oňyn netijelere ýykgyn ediň.

Tapmak köp wagt alýar we operasiýa kyn.

- Diňe hil taýdan synag edilip bilner.

Ikinji nesil floresan mukdar PCR

Floresan mukdar PCR (Real-Time PCR), qPCR diýlip hem atlandyrylýar, reaksiýa ulgamynyň gidişini görkezip bilýän floresan zondlary goşmak bilen güýçlendirilen önümleriň ýygnanmagyna gözegçilik etmek üçin ulanylýar we netijelere floresan egrisi arkaly baha berilýär we Cq bahasy we adaty egriniň kömegi bilen bahalandyrylyp bilner.

QPCR tehnologiýasy ýapyk ulgamda amala aşyrylýandygy sebäpli, hapalanmak ähtimallygy azalýar we mukdar taýdan kesgitlemek üçin floresan signalyna gözegçilik edilip bilner, şonuň üçin kliniki tejribede iň giňden ulanylýar we PCR-de agdyklyk edýän tehnologiýa öwrüldi.

Hakyky floresan mukdar PCR-de ulanylýan floresan maddalary: TaqMan floresan zondlary, molekulýar maýaklar we floresan boýaglar.

1) TaqMan floresan zondy:

PCR güýçlendirilende, bir jübüt primer goşulanda belli bir floresan zond goşulýar.Synag oligonukleotid bolup, iki ujuna degişlilikde habarçy floresan topary we söndüriji floresan topary diýilýär.

Synag üýtgemänsoň, habarçy topary tarapyndan çykýan floresan signal söndüriji topar tarapyndan sorulýar;PCR güýçlendirilende, Taq fermentiniň 5′-3 ′ ekzonukleýasiýa işjeňligi barlagy ýapýar we peseldýär, habarçy floresan topary we söndüriji bolýar

2) SYBR floresan boýaglar:

PCR reaksiýa ulgamynda artykmaç SYBR floresan boýag goşulýar.SYBR floresan boýagy DNK goşa hatara ýörite goşulmansoň, floresan signal çykarýar.Zynjyryň içine girmedik SYBR boýag molekulasy hiç hili floresan signal çykarmaz we şeýlelik bilen floresan signalyny üpjün eder PCR önümleriniň köpelmegi PCR önümleriniň köpelmegi bilen doly sinhronlanýar.SYBR diňe iki hatar DNK bilen baglanyşýar, şonuň üçin ereýän egri PCR reaksiýasynyň aýratynlygyny ýa-da ýokdugyny kesgitlemek üçin ulanylyp bilner.

3) Molekulýar maýaklar

Iki we 5 belgili oligonukleotid zondy, 5 we 3 ujunda takmynan 8 bazadan ybarat saç düzümini emele getirýär.Iki ujundaky nuklein kislotasynyň yzygiderliligi biri-biri bilen jübütlenip, floresan toparynyň we söndüriji toparyň berk bolmagyna sebäp bolýar..Akyn bolsa, floresan öndürmez.

PCR önümi döredilenden soň, anneasiýa prosesinde molekulýar maýagyň orta bölegi belli bir DNK yzygiderliligi bilen jübütlenýär we floresan geni floresan öndürmek üçin söndüriji gen bilen bölünýär.

Ikinji nesil PCR-iň esasy kemçilikleri:

Duýgurlyk henizem ýetmezçilik edýär we pes göçürme nusgalarynyň tapylmagy takyk däl.

Fon bahasynyň täsiri bar we netijede päsgelçilik döreýär.

Üçünji nesil sanly PCR

Sanly PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ahyrky yzygiderliligi kesgitlemek arkaly maksat yzygiderliliginiň göçürme sanyny hasaplaýar we içerki gözegçilikleri we adaty egrileri ulanman takyk mukdar taýdan kesgitlemäni ýerine ýetirip biler.

Sanly PCR ahyrky nokady kesgitleýär we Ct bahasyna (sikl bosagasyna) bagly däl, şonuň üçin sanly PCR reaksiýasy güýçlendirme netijeliligine az täsir edýär we ýokary reaksiýa we köpelmek bilen PCR reaksiýa inhibitorlaryna çydamlylygy ýokarlanýar.

Highokary duýgurlygyň we ýokary takyklygyň aýratynlyklary sebäpli PCR reaksiýa ingibitorlary aňsatlyk bilen päsgel bermeýär we gözleg we amaly nokadyna öwrülen adaty önümler bolmazdan hakyky mutlak mukdary gazanyp biler.

Reaksiýa bölüminiň dürli görnüşlerine görä, ony üç görnüşe bölmek bolar: mikrofliid, çip we damja ulgamlary.