QPCR synaglarynda başlangyç dizaýn hem örän möhüm baglanyşykdyr.Astarlaryň laýykdygy ýa-da ýokdugy güýçlendirme netijeliliginiň standartlara ýetýändigi ýa-da güýçlendirilen önümleriň aýratynlygy ýa-da synag synaglarynyň netijeleriniň elýeterliligi bilen ýakyn baglanyşyklydyr.
Onda, qPCR başlangyç aýratynlygyny nädip has gowulaşdyrmaly?Güýçlendirmegiň ýokary netijeliligi?
Bu gün, sizi qPCR başlangyçlaryny bilelikde dizaýn ederis we qPCR başlangyç dizaýnyny synaglarda täsirli ussatlyga öwüreris.
“QPCR” desgalary taslanylanda, adatça aşakdaky nokatlara üns beriň: primerler mümkin boldugyça içerde dizaýn edilmeli, önümiň uzynlygy 100-300 bp, Tm bahasy mümkin boldugyça 60 ° C, ýokarky we aşaky akymlar mümkin boldugyça ýakyn bolmaly, asmanyň soňy G ýa-da C bolmaly we ş.m. garaşmaly.
1. Içerki bölekleri öz içine alýan desgalaryň dizaýny
QPCR primerleri dizaýn edilende, içerde düzülen primerleri saýlamak gDNA şablonynyň güýçlendirilmeginiň öňüni alyp biler we önümleriň hemmesi cDNA güýçlendirilmeginden emele gelýär, şeýlelik bilen gDNA hapalanmagynyň täsirini ýok edýär.
2. Esasy uzynlyk
Astaryň uzynlygy, adatça, 18-30 nt aralygyndadyr we güýçlendiriji önümiň uzynlygy mümkin boldugyça 100-300 at güýji aralygynda dolandyrylmalydyr.
Astar gaty gysga bolsa, ýörite däl güýçlendirilmegine getirer we gaty uzyn bolsa, aňsatlyk bilen ikinji derejeli gurluşy emele getirer (meselem, saç düzümi).Güýçlendirmek önümi gaty uzyn bolsa, PCR güýçlendirmegiň netijeliligine täsir etjek polimerazyň reaksiýasy üçin amatly däl.
3. GC mazmuny we Tm bahasy
Astarlaryň GC mazmuny 40% bilen 60% arasynda gözegçilik edilmelidir.Örän ýokary ýa-da gaty pes bolsa, reaksiýany başlatmak üçin amatly däl.Öňe we tersine primerleriň GC mazmuny, şol bir Tm bahasyny we gyzdyryjy temperaturany almak üçin birmeňzeş bolmaly.
Tm bahasy mümkin boldugyça 55-65 ° C arasynda bolmaly, adatça 60 ° C töweregi bolmaly, ýokarky we aşaky akymyň Tm bahasy mümkin boldugyça ýakyn bolmaly, has gowusy 4 ° C-den köp bolmaly däldir.
4. Astaryň 3 ′ ujunda A saýlamakdan gaça duruň
Astaryň 3 ′ ujy gabat gelmese, dürli esaslaryň sintez netijeliliginde uly tapawutlar bolýar.Iň soňky esas A bolanda, gabat gelmedik ýagdaýynda-da zynjyr sintezini başlap biler we iň soňky esas T bolanda, gabat gelmeýän induksiýanyň netijeliligi ep-esli peselýär.Şonuň üçin primeriň 3 ′ ujunda A saýlamazlyga synanyşyň, T.-ni saýlamak has gowudyr.
Synag desgasy bolsa, synagyň 5 ′ ujy G bolup bilmez, sebäbi ýekeje G bazasy FAM floresan habarçy toparyna birikdirilen ýagdaýynda-da, G FAM topary tarapyndan çykarylan floresan signalyny hem öçürip biler, bu bolsa ýalňyş negatiw netijelere getirer.Görün.
5. Esasy paýlama
Astardaky dört bazanyň paýlanyşy, tötänleýin, 3 ′ ujunda yzly-yzyna 3 G ýa-da C-den we yzygiderli 3-den köp saklanar.G ýa-da C, GC baý yzygiderlilik sebitinde jübütleşmek aňsat.
6. Esasy dizaýn sebiti çylşyrymly ikinji derejeli gurluşlardan gaça durmalydyr.
Güýçlendiriji önümiň bir hatary bilen emele gelen ikinji derejeli gurluş, PCR-iň oňat ösüşine täsir eder.Maksat yzygiderliliginde ikinji derejeli gurluşyň bardygyny ýa-da ýokdugyny öňünden çaklamak bilen, deslapky dizaýnda bu sebitden gaça durmaga synanyşyň.
7. Astarlaryň özleri we primerleriň arasynda yzygiderli goşmaça esaslardan gaça durmaga synanyşmaly.
Astaryň özi bilen primeriň arasynda yzygiderli 4 esasy goşundy bolup bilmez.Astaryň özi goşmaça yzygiderlilik bolmaly däldir, ýogsam primer bilen şablonyň birleşmegine täsir etjek saç düzümini emele getirer.
Stokarky we aşaky akymlaryň arasynda goşmaça yzygiderlilik bolup bilmez.Astarlaryň arasyndaky doldurgyç, PCR netijeliligini peselder we hatda mukdar takyklygyna täsir eder.Astar ölçegli we saçly gurluşlar gutulgysyz bolsa, △ G bahasy gaty ýokary bolmaly däldir (4,5 kkal / moldan az bolmaly).
8. Astarlar maksatly önümi güýçlendirýär.
QPCR kesgitlemegiň esasy maksady, maksatly geniň köplügine düşünmekdir.Specificörite däl güýçlendirme ýüze çyksa, mukdar nädogry bolar.Şonuň üçin desgalar dizaýn edilenden soň, olary BLAST synagdan geçirmeli we önümleriň aýratynlygy yzygiderlilik maglumatlar bazasynda deňeşdirilýär.
Ondan soň, qPCR başlangyçlaryny dizaýn etmek üçin adam GAS6 (Ösüş tussaglygy aýratyn 6) genini alarys.
01 talap geni
Homo GAS6NCBI arkaly.Bu ýerde, geniň adyny we görnüşleriniň yzygiderliligini üpjün etmek üçin deňeşdirmäge üns bermelidiris.
02 Gen yzygiderliligini tapyň
(1) Maksat yzygiderliligi genom DNK bolsa, geniň genom DNK yzygiderliligini saýlaň.
(2) Maksat yzygiderliligi mRNA bolsa, ikinjisini saýlaň.Gireniňizden soň aşakdaky tablisadaky "CDS" -e basyň.Goňur fon yzygiderliligi geniň kodlaşdyryş yzygiderliligi.
03 Dizaýn desgalary
Primer-BLAST interfeýsini giriziň
Gen yzygiderliliginiň belgisini ýa-da ýokarky çep tarapdaky Fasta formatynda yzygiderliligi giriziň we degişli parametrleri dolduryň.

“Primerleri al” düwmesine basyň we NCBI açylar, şeýle parametrleriň saýlanylyşynyň beýleki bölüniş wariantlaryna güýçlendiriljekdigini habar berer.Dürli bölüniş wariantlaryny barlap, degişli primer jübütini almak üçin iberip bileris (aşakdaky suratda görkezilişi ýaly).Bu amal işlemek üçin onlarça sekunt gerek bolup biler.
Bu başlangyç jübütleriň gyzdyryjy temperaturasy 60 ° C töweregi.Synagyň maksadyna görä, ortaça uzynlygy, gowy aýratynlygy we synag üçin primerleriň öz-özüni doldurmagy bilen primerleri saýlaň we üstünlik derejesi gaty ýokary!
04Primer aýratynlygyny barlamak
Aslynda, “Primer-Blast” primerleri dizaýn etmekden başga-da, özümiziň döreden primerlerimize hem baha berip biler.Esasy dizaýn sahypasyna gaýdyp geliň, dizaýn eden ýokarky we aşaky akymlary giriziň we beýleki parametrler düzedilmez.Ibereniňizden soň, jübütleriň beýleki genlerde-de bardygyny ýa-da ýokdugyny görüp bilersiňiz.Bularyň hemmesi güýçlendirmek isleýän genimizde görkezilse, bu jübüt jübütleriň aýratynlygynyň ajaýypdygyny görkezýär!(Mysal üçin, bu deslapky soragyň ýeke-täk netijesi!)

05 Esasy hil hökümi
“Güýçlendirmek netijeliligini standartlara çenli”, “güýçlendirilen önüm aýratynlyklary” we “ygtybarly synag netijeleri” birleşdirýän “iň oňat” primer haýsy?
Güýçlendirmek netijeliligi

ereýän egri
Astarlaryň güýçlendirme netijeliligi 90% -110% -e ýetýär, bu güýçlendirme netijeliliginiň gowydygyny, ereýän egriniň bolsa iň ýokary derejesine we adatça Tm> 80 ° C-e ýetýändigini aňladýar, bu bolsa güýçlendiriş aýratynlygynyň gowydygyny aňladýar.
 
Degişli önümler:
Hakyky wagt PCR aňsat - SYBR REaşyl I.
Real wagt PCR aňsat-takman