一 the Reaksiýa ulgamynyň duýgurlygyny ýokarlandyrmak ：

1. qualityokary hilli RNK izolýasiýa ：

Üstünlikli cDNA sintezi ýokary hilli RNK-dan gelýär.Qualityokary hilli RNK iň bolmanda doly uzyn bolmaly we EDTA ýa-da SDS ýaly ters transkriptaz ingibitorlaryndan erkin bolmaly.RNK-nyň hili, cDNA-a ýazyp boljak yzygiderlilik maglumatlarynyň iň köp mukdaryny kesgitleýär.Adaty RNK arassalaýyş usuly, guanidin izotiosýanat / kislota fenolyny ulanmak bilen bir basgançakly usuldyr.RNase mukdary bilen hapalanmagynyň öňüni almak üçin, RNase baý nusgalardan izolirlenen RNK (aşgazan asty mäz ýaly) ýokary hilli RNK-ny, esasanam uzak möhletli saklamak üçin formaldegidde saklanmalydyr.Syçan bagyryndan alnan RNK, bir hepde suwda saklanandan soň esasan peseldi, syçan dalagyndan alnan RNK 3 ýyl suwda saklanandan soň durnukly boldy.Mundan başga-da, 4 kb-dan uzyn ýazgylar, kiçijik ýazgylara garanyňda, RNases yzlary bilen zaýalanmaga has duýgur.Saklanan RNK nusgalarynyň durnuklylygyny ýokarlandyrmak üçin RNK deionizirlenen formamidde eräp, -70 ° C derejesinde saklanyp bilner.RNK-ny goramak üçin ulanylýan formamid, RNK-ny zaýalaýan galyndylardan azat bolmalydyr.Aşgazan astyndaky RNK azyndan bir ýyl formamidde saklanyp bilner.RNK ulanmaga taýýarlananyňyzda, RNK-ny çökdürmek üçin aşakdaky usuly ulanyp bilersiňiz: NaCl-i 0,2M we etanolyň mukdaryndan 4 esse goşuň, otag temperaturasynda 3-5 minut goýuň we sentrifuga 10 000 × g 5 minutda goşuň.

2. RNaseH-hereketsiz (RNaseH-) ters transkriptaz ulanyň ：

CDNA sinteziniň uzynlygyny we hasyllylygyny ýokarlandyrmak üçin RNK inhibitorlary köplenç ters transkripsiýa reaksiýalaryna goşulýar.Buferiň we peseldiji serişdäniň (DTT ýaly) barlygynda birinji hatar sintez reaksiýasynda RNase ingibitorlary goşulmalydyr, sebäbi cDNA sintezinden öň amal inhibitory görkezýär, şeýlelik bilen RNK-ny peseldip bilýän RNase goýberýär.Belok RNase ingibitorlary diňe RNase A, B, C tarapyndan RNK-nyň zaýalanmagynyň öňüni alýar we deride RNase-iň öňüni almaýar, şonuň üçin bu ingibitorlaryň ulanylmagyna garamazdan RNase barmaklaryňyzdan tanatmaň.

Ters transkriptaz RNK-nyň cDNA öwrülmegine kataliz berýär.M-MLV we AMV ikisiniň hem polimeraza işjeňligine goşmaça endogen RNaseH işjeňligi bar.RNaseH işjeňligi we polimeraza işjeňligi, RNA şablony bilen DNK primeri ýa-da cDNA uzaldyş zolagynyň arasynda emele gelen gibrid zolak üçin biri-biri bilen bäsleşýär we RNK: DNK toplumyny peseldýär.RNaseH işjeňligi bilen zaýalanan RNK şablony, cDNA sinteziniň hasyllylygyny we uzynlygyny azaldýan cDNA sintezi üçin täsirli substrat bolup bilmez.Şol sebäpli ters transkriptazyň RNaseH işjeňligini ýok etmek ýa-da ep-esli azaltmak peýdaly bolardy .。

SuperScript Ⅱ ters transkriptaz, RNaseH- MMLV ters transkriptaz we termoScript ters transkriptaz, RNaseH- AMV, MMLV we AMV-den has köp mukdarda we doly uzynlykly CDNA alyp biler.RT-PCR duýgurlygy cDNA sinteziniň mukdaryna täsir eder.ThermoScript AMV-den has duýgur.RT-PCR önümleriniň göwrümi, tersine transkriptazyň cDNA-ny sintez etmek ukyby bilen çäklendirilýär, esasanam has uly CDNA-lary klonlaşdyranda.MMLV bilen deňeşdirilende, SuperScripⅡ uzyn RT-PCR önümleriniň öndürijiligini ep-esli ýokarlandyrdy.RNaseH-ters transkriptaz hem termostilligi ýokarlandyrdy, şonuň üçin reaksiýa adaty 37-42 ° C-den ýokary temperaturalarda amala aşyrylyp bilner.Teklip edilýän sintez şertlerinde oligo (dT) primer we 10 μCi [α-P] dCTP ulanyň.Birinji sapagyň umumy hasyly TCA ýagyş usuly bilen hasaplandy.Doly uzynlykdaky CDNA aksizlenen we gidroksidi agarose jeline sanalýan ululykdaky görnüşli zolaklar arkaly derňeldi.

3. Ters transkripsiýa üçin inkubasiýa temperaturasyny ýokarlandyryň ：

Has ýokary inkubasiýa temperaturasy, reaksiýanyň hasyllylygyny ýokarlandyryp, RNK ikinji derejeli gurluşyny açmaga kömek edýär.RNK şablonlarynyň köpüsi üçin RNK we primerleri 65 ° C-de bufer ýa-da duzsyz inkubasiýa etmek, soň bolsa buzda çalt sowatmak ikinji derejeli gurluşlary ýok eder we primerleriň baglanyşmagyna mümkinçilik döreder.Şeýle-de bolsa, käbir şablonlarda ýylylyk denaturasiýasyndan soňam ikinji derejeli gurluşlar bar.Bu kyn şablonlary güýçlendirmek, ThermoScript Ters Transkriptazany ulanyp we güýçlendirmek işini gowulandyrmak üçin ters transkripsiýa reaksiýasyny has ýokary temperaturada ýerleşdirip bolýar.Ubokary inkubasiýa temperaturasy, aýratyn-da cDNA sintezi üçin genlere mahsus primerler (GSP) ulanylanda aýratynlygy artdyryp biler (3-nji bölüme serediň).GSP ulanýan bolsaňyz, primerleriň Tm-i garaşylýan inkubasiýa temperaturasy bilen deňdigine göz ýetiriň.Oligo (dT) we 60 ° C-den ýokary tötänleýin primerleri ulanmaň.Tötänleýin desgalar, 60 ° C-e ýetmezden ozal 25 ° C-de 10 minutlap inkubasiýa talap edýär.Has ýokary ters transkripsiýa temperaturasyny ulanmakdan başga-da, RNK / primer garyndysyny 65 ° C denatasiýa temperaturasyndan ters transkripsiýa inkubasiýa temperaturasyna gönüden-göni geçirmek we öňünden gyzdyrylan 2 × reaksiýa garyndysyny (cDNA gyzgyn başlangyç sintezi) goşmak arkaly aýratynlygy ýokarlandyrylyp bilner.Bu çemeleşme, has pes temperaturada ýüze çykýan birek-birekli esasy jübütleşmegiň öňüni almaga kömek edýär.RT-PCR üçin zerur bolan birnäçe temperatura kommutasiýa termiki welosiped ulanyp aňsatlaşdyrylyp bilner.

Üçünji termostable polimeraza, Mg2 + barlygynda DNK polimeraza we Mn2 + bar bolan RNK polimeraza hökmünde hereket edýär.Iň ýokary temperaturada 65 ° C-de ýyly saklap bolýar.Şeýle-de bolsa, PCR wagtynda Mn2 + -iň bolmagy wepalylygy peseldýär, bu bolsa TD polimerazyny CDNA klonlamak ýaly ýokary takyklyk güýçlendirmek üçin has amatly edýär.Mundan başga-da, Tth duýgurlygy peseldýän pes ters transkripsiýa netijeliligine eýedir we ters transkripsiýa we PCR bir ferment bilen ýerine ýetirilip bilinýändigi sebäpli, CDNA güýçlendiriji önümleri hapalanan genom DNK bilen deňeşdirmek üçin ters transkripsiýasyz gözegçilik reaksiýalary ulanylyp bilinmez.Güýçlendirmek önümleri aýryldy.

4. Ters transkripsiýany öňe sürýän goşundylar ：

Glikerol we DMSO ýaly goşundylar birinji hatar sintez reaksiýasyna goşulýar, bu nuklein kislotasynyň iki hatar durnuklylygyny peseldip we RNK-nyň ikinji gurluşyny açyp biler.SuperScript II ýa-da MMLV işjeňligine täsir etmezden 20% -e çenli gliserol ýa-da 10% DMSO goşup bolýar.AMV, işjeňligini ýitirmezden, 20% -e çenli gliserola çydam edip biler.SuperScriptⅡ ters transkripsiýa reaksiýasynda RT-PCR duýgurlygyny ýokarlandyrmak üçin 45% C-de 10% gliserol goşulyp we inkubasiýa edilip bilner.Tersine transkripsiýa reaksiýa önüminiň 1/10 bölegi PCR-e goşulsa, güýçlendirme reaksiýasynda gliserolyň konsentrasiýasy 0,4% bolup, PCR-ni saklamak üçin ýeterlik däl.

5. RNaseH bejergisi ：

PCR-den öň RNaseH bilen cDNA sintez reaksiýalaryny bejermek duýgurlygy ýokarlandyryp biler.Käbir galyplar üçin, cDNA sintez reaksiýasyndaky RNK güýçlendiriji önümleriň baglanyşmagynyň öňüni alýar, bu ýagdaýda RNaseH bejergisi duýgurlygy ýokarlandyryp biler.Adatça, pes göçürme inçekesel II ýaly has uzyn doly cDNA maksatly şablonlary güýçlendirilende RNaseH bejergisi zerurdyr.Bu kyn şablon üçin RNaseH bejergisi SuperScript II ýa-da AMV-sintezlenen cDNA tarapyndan öndürilen signaly güýçlendirdi.RT-PCR reaksiýalarynyň köpüsi üçin RNaseH bejergisi islege bagly däl, sebäbi 95 ° C-den PCR denatasiýa ädimi, adatça RNK-da RNK gidrolizleýär: DNK toplumy.

6. Ownuk RNK kesgitlemegiň usulyny gowulandyrmak ：

Diňe az mukdarda RNK bar bolsa, RT-PCR aýratyn kyn.RNK izolýasiýasy wagtynda daşaýjy hökmünde goşulan glikogen ownuk nusgalaryň hasyllylygyny ýokarlandyrmaga kömek edýär.RNazsyz glikogen Trizol goşmak bilen bir wagtda goşulyp bilner.Glikogen suwda ereýär we soňraky ýagyşlara kömek etmek üçin RNK bilen suwly fazada saklanyp bilner.50 mg-dan az dokuma ýa-da 106 medeniýetli öýjük üçin RNase-den erkin glikogeniň maslahat berilýän konsentrasiýasy 250 μg / ml.

SuperScript II ulanyp ters transkripsiýa reaksiýasyna asetilleşdirilen BSA goşmak, duýgurlygy ýokarlandyryp biler we az mukdarda RNK üçin SuperScript II mukdaryny azaldyp, 40 birlik RNaseOut nukleaza inhibitory goşup, kesgitleme derejesini ýokarlandyryp biler.Glikogen RNK izolýasiýa prosesinde ulanylsa, tersine transkripsiýa reaksiýasy üçin SuperScript II ulanylanda henizem BSA ýa-da RNase inhibitoryny goşmak maslahat berilýär.

RT RT RT-PCR aýratynlygyny ýokarlandyrmak

1. CND asintezi ：

Birinji hatar cDNA sintezi üç dürli usuly ulanyp başlap bolar, deňeşdirilen aýratynlygy sintezlenen cDNA mukdaryna we görnüşine täsir edýär.

Tötänleýin başlangyç usuly üç usulyň iň azydy.Primerler gysga, bölekleýin uzynlykly CDNA-lary döredip, transkripsiýanyň dowamynda birnäçe saýtda anneal.Bu usul ýygy-ýygydan 5 ′ ahyrky yzygiderliligi almak we ikinji derejeli gurluş sebitleri bolan RNK şablonlaryndan ýa-da ters transkriptaz bilen köpeldip bolmaýan ýatyryş ýerleri bilen CDNA almak üçin ulanylýar.Iň uzyn cDNA almak üçin, her RNK nusgasyndaky primerleriň RNK bilen gatnaşygy empirik taýdan kesgitlenmeli.Tötänleýin primerleriň başlangyç konsentrasiýasy 20 μl reaksiýa üçin 50-den 250 ng aralygyndady.Jemi RNK-dan sintez edilen CDNA, esasan, ribosomal RNK bolany üçin, poli (A) + RNA şablon hökmünde saýlanýar.

Oligo (dT) primerleri tötänleýin primerlerden has anyk.Eukariotik mRNA-laryň 3 ′ ujunda tapylan poli (A) guýrugyna gibridlenýär.Poli (A) + RNK umumy RNK-nyň takmynan 1% -den 2% -ine çenli bolany üçin, cDNA-nyň mukdary we çylşyrymlylygy tötänleýin primerlerden has az.Oligo (dT) ýokary aýratynlygy sebäpli, adatça RNK-nyň primerlere we poli (A) + saýlama gatnaşygy optimizasiýasyny talap etmeýär.20μl reaksiýa ulgamyna 0,5μg oligo (dT) ulanmak maslahat berilýär.oligo (dT) 12-18, RT-PCR-iň köpüsi üçin amatly.ThermoScript RT-PCR ulgamy, has ýokary inkubasiýa temperaturasy üçin has gowy ýylylyk durnuklylygy sebäpli oligo (dT) 20 hödürleýär.

Gen aýratyn primerleri (GSP) ters transkripsiýa ädimi üçin iň anyk başlangyçlardyr.GSP, ähli RNK-lary birleşdirýän tötänleýin primerlerden ýa-da oligo (dT) -den tapawutlylykda, RNK maksatly yzygiderliligine gibridlenip bilýän antisense oligonukleotiddir.PCR primerlerini dizaýn etmek üçin ulanylýan şol bir düzgün, ters transkripsiýa reaksiýalarynda GSP dizaýnyna degişlidir.GSP mRNA-nyň 3 ′ iň ujuna birikdirilen güýçlendiriji primer bilen birmeňzeş bolup biler ýa-da GSP ters güýçlendiriji primeriň aşaky akymyna birikdirilip bilner.Käbir güýçlendirilen dersler üçin üstünlikli RT-PCR üçin birden köp antisense primeri dizaýn edilmeli, sebäbi maksatly RNK-nyň ikinji derejeli gurluşy deslapky baglanyşygyň öňüni alyp biler.20 μl birinji hatar sintez reaksiýasynda 1 pmol antisense GSP ulanmak maslahat berilýär.

2. Ters transkripsiýa üçin inkubasiýa temperaturasyny ýokarlandyryň ：

GSP aýratynlygynyň doly artykmaçlygyndan doly peýdalanmak üçin has ýokary termostallygy bolan ters transkriptaz ulanylmaly.Termostable ters transkriptazlar, reaksiýanyň berkligini ýokarlandyrmak üçin has ýokary temperaturada inkubasiýa edilip bilner.Mysal üçin, 55 ° C-de GSP anneallary bar bolsa, AMV ýa-da M-MLV 37 ° C pes peslikde ters transkripsiýa üçin ulanylsa, GSP-iň aýratynlygy doly ulanylmaz.Şeýle-de bolsa, SuperScript II we ThermoScript 50 ° C ýa-da ondanam ýokary reaksiýada bolup biler, bu bolsa pes temperaturada öndürilýän önümleri ýok eder.Iň ýokary aýratynlyk üçin, RNK / primer garyndysy gönüden-göni 65 ° C denatasiýa temperaturasyndan ters transkripsiýa inkubasiýa temperaturasyna geçirilip bilner we öňünden gyzdyrylan 2 × reaksiýa garyndysyna (cDNA sintezi gyzgyn başlangyç) goşulyp bilner.Bu pes temperaturada birek-birege esasly jübütleşmegiň öňüni almaga kömek edýär.RT-PCR üçin zerur bolan birnäçe temperatura geçişleri termiki welosiped ulanyp aňsatlaşdyrylyp bilner.

3. Genomiki DNK hapalanmagyny azaldar ：

RT-PCR bilen ýüze çykyp biljek kynçylyk, RNK-da genom DNK-nyň hapalanmagydyr.Trizol Reagent ýaly gowy RNK izolýasiýa usulyny ulanmak, RNK taýýarlygyny hapalaýan genom DNK mukdaryny azaldar.Genomiki DNK-dan alnan önümlerden gaça durmak üçin RNK güýçlendirme derejeli DNase I bilen bejerilip bilner, tersine transkripsiýadan öň hapalanýan DNK-ny aýyrmak üçin.DNase I siňdirişi, nusgalary 2,0 mM EDTA-da 65 ° C-de 10 minutlap inkubasiýa etmek bilen bes edildi.EDTA ýokary temperaturada magniý ionyna bagly RNK gidroliziniň öňüni alyp, magniý ionlaryny çişirip biler.

Güýçlendirilen cDNA-ny genom DNK güýçlendiriji önümlerden hapalamak üçin, her bir anneonyň eksonlary bölmek üçin primerleri düzülip bilner.CDNA-dan alnan PCR önümleri hapalanan genom DNK-dan has gysga bolar.Mundan başga-da, berlen bölekleriň genom DNK-dan ýa-da CDNA-dan alnandygyny anyklamak üçin her RNK şablonyna ters transkripsiýasyz gözegçilik synagy geçirildi.Tersine transkripsiýasyz alnan PCR önümi genomdan alnan.