Başlangyç material: RNK
Mukdar ters transkripsiýa PCR (RT-qPCR), başlangyç synag hökmünde RNK ulanyp, PCR synaglarynda ulanylýan synag usulydyr.Bu usulda jemi RNK ýa-da habarçy RNK (mRNA) ilki tersine transkriptaz arkaly goşmaça DNK (cDNA) görnüşine geçirilýär.Netijede, şablon hökmünde cDNA ulanyp, bir qPCR reaksiýasy ýerine ýetirildi.RT-qPCR geni aňlatmagyň derňewi, RNK päsgelçiligini barlamak, mikroarraý barlagy, patogen kesgitlemek, genetiki synag we kesel gözlegleri ýaly dürli molekulýar biologiýa goşundylarynda ulanyldy.
RT-qPCR üçin bir ädim we iki basgançakly usul
RT-qPCR bir basgançakly ýa-da iki basgançakly usul bilen amala aşyrylyp bilner.Bir basgançakly RT-qPCR ters transkripsiýa we PCR güýçlendirme birleşdirýär, ters transkriptaza we DNK polimeraza şol bir bufer şertlerinde şol bir turbada reaksiýany tamamlamaga mümkinçilik berýär.Bir basgançakly RT-qPCR diňe yzygiderlilige esaslanýan primerleri ulanmagy talap edýär.Iki basgançakly RT-qPCR-de, dürli optimallaşdyrylan buferleri, reaksiýa şertlerini we başlangyç dizaýn strategiýalaryny ulanyp, iki sany turbada ters transkripsiýa we PCR güýçlendirmek amala aşyrylýar.
| Üstünlik | Adetmezçiligi | |
| Bir ädim | Bu usul, synaglaryň ýalňyşlygy az, sebäbi iki reaksiýa bir turbada edilýär
Az turba geçiriji ädimler hapalanmak howpuny azaldýar
Throughokary geçirijilik güýçlendirmek / barlamak, çalt we köpelmek üçin amatly | Iki basgançakly reaksiýalary aýratyn optimizirläp bolmaz
Iki basgançakly reaksiýany birleşdirmek bilen reaksiýa şertleri bozulanlygy sebäpli, duýgurlyk iki basgançakly usul ýaly gowy däl
Bir nusga bilen kesgitlenen nyşanlaryň sany az |
| Iki ädim | Uzak wagtlap saklanyp bilinýän we köp reaksiýada ulanylyp bilinýän durnukly cDNA kitaphanalaryny döretmek ukyby
Maksatly genler we salgylanma genleri şol bir cDNA kitaphanasyndan köp sanly cDNA kitaphanalaryna zerurlyk bolmazdan güýçlendirilip bilner
Reaksiýa buferleri we ýekeje reaksiýany optimizirlemäge mümkinçilik berýän reaksiýa şertleri işleýär
Trigger şertleriniň çeýe saýlanmagy | Birnäçe turba ulanmak we has köp turba geçiriji ädimler DNK hapalanmak howpuny ýokarlandyrýar, we wagt talap edýär.
Bir basgançakly usuldan has optimizasiýa talap edýär |
Degişli önümler:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Bir ädim) -SYBR Greenaşyl I.
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Bir ädim) -Takman
RT Easyᵀᴹ Birinji hatar CDNA sintezi üçin ussat premiks
Hakyky wagt PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Jemi RNK we mRNA saýlamak
RT-qPCR synag geçirilende, umumy RNK ýa-da arassalanan mRNA-ny ters transkripsiýa üçin şablon hökmünde ulanmak ýa-da ulanmazlyk barada karar bermek möhümdir.MRNA birneme ýokary duýgurlygy üpjün edip bilse-de, jemi RNK henizem ulanylýar.Munuň sebäbi, umumy RNK-nyň başlangyç material hökmünde mRNA-dan has möhüm artykmaçlygydyr.Ilki bilen, şablonyň mukdar taýdan dikeldilmegini we öýjük sanlaryna başlamagyň netijeleriniň has kadalaşmagyny üpjün edýän has az arassalaýyş ädimleri talap edilýär.Ikinjiden, dürli mRNA-laryň dürli dikeldişleri sebäpli gümürtik netijeleriň döremeginiň öňüni alyp biljek mRNA baýlaşdyryş ädiminden gaça durýar.Umuman aýdanyňda, programmalaryň köpüsinde maksatly geniň deňeşdirilişiniň ýüze çykarylyşynyň mutlak duýgurlygyndan has möhümdigi sebäpli, umumy RNK köp halatlarda has amatlydyr.
Tersine transkripsiýa primeri
Iki basgançakly usulda, cDNA reaksiýasyny güýçlendirmek üçin üç dürli usul ulanylyp bilner: oligo (dT) primerler, tötänleýin primerler ýa-da yzygiderlilige mahsus primerler.Adatça, oligo (dT) primerleri we tötänleýin primerler bilelikde ulanylýar.Bu primerler mRNA şablonyna birikdirilýär we sintez üçin başlangyç nokat bilen ters transkriptazany üpjün edýär.
| Esasy saýlaw | Gurluşy we işleýşi | Üstünlik | Adetmezçiligi |
| Oligo (dT) primer (ýa-da labyrly oligo (dT) primer) | MRNA-nyň poli (A) guýrugynda timiniň galyndylaryna giňelmek;labyr oligo (dT) primerinde 3 ′ ujunda G, C ýa-da A bar (labyr saýty) | Poli (A) görnüşli mRNA-dan doly uzynlykdaky CDNA sintezi
Az başlangyç material bar bolsa ulanylýar
Gämi duralgasy, oligo (dT) primeriniň mRNA-nyň 5 ′ poli (A) guýrugyna baglanmagyny üpjün edýär | Diňe poli (A) guýruklary bilen genleri güýçlendirmek üçin amatly
Poli (A) deslapky ýerden * 2 kesilen CDNA alyň
3 ′ ujuna * bagly *
* Gämi oligo (dT) primerleri ulanylsa, bu mümkinçilik azaldylýar |
| tötänleýin primer
| Uzynlygy 6-dan 9-a çenli, RNK transkripsiýasy wagtynda birnäçe saýta birikdirilip bilner | Rhli RNK-lara (tRNA, rRNA we mRNA)
Möhüm ikinji derejeli gurluşly ýazgylar ýa-da az başlangyç material bar bolsa amatly
CDokary cDNA hasyl | cDNA, adatça islenmeýän we maksatly mRNA signalyny eritip bilýän ähli RNK-dan tersine ýazylýar
kesilen CDNA alyň |
| yzygiderlilik aýratynlyklary | Aýratyn mRNA yzygiderliligini nyşana alýan ýöriteleşdirilen desgalar | ýörite cDNA kitaphanasy
Duýgurlygy ýokarlandyrmak
Ters qPCR primerlerini ulanmak | Diňe bir maksatly geniň sintezi bilen çäklenýär |
Tersine transkriptaz
Ters transkriptaz, DNK sintez etmek üçin RNK ulanýan fermentdir.Käbir ters transkriptazlarda RNase işjeňligi bar we transkripsiýadan soň RNK-DNK gibrid zolaklarynda RNK zolaklaryny peseldip biler.RNase ferment işjeňligi ýok bolsa, has ýokary qPCR netijeliligi üçin RNaseH goşup bolýar.Köplenç ulanylýan fermentlere Moloneý murin leýkemi wirusy ters transkriptaz we guş miýeloblastoma wirusy ters transkriptaz degişlidir.RT-qPCR üçin, has ýokary termostallygy bolan ters transkriptazany saýlamak idealdyr, şonuň üçin CDNA sintezi has ýokary temperaturada ýerine ýetirilip bilner, ýokary derejeli gurluşly RNK-leriň üstünlikli transkripsiýasyny üpjün edip, reaksiýanyň dowamynda doly işjeňligini dowam etdirer we netijede CDNA has ýokary hasyl berer.
Degişli önümler:
Foreasy M-MLV ters transkriptaz
Tersine transkriptazyň RNase H işjeňligi
RNaseH, iki hatar DNK-ny netijeli sintez etmäge mümkinçilik berýän RNK-DNK duplekslerinden RNK zolaklaryny peseldip bilýär.Şeýle-de bolsa, uzyn mRNA şablon hökmünde ulanylanda, RNK wagtyndan öň peselip biler, netijede CDNA kesilip bilner.Şonuň üçin uzyn ýazgylaryň sintezi islenýän bolsa, köplenç CDNA klonlaşdyrylanda RNaseH işjeňligini azaltmak peýdalydyr.Munuň tersine, RNase H işjeňligi bilen ters transkriptazlar köplenç qPCR programmalary üçin peýdalydyr, sebäbi PCR-iň birinji aýlawynda RNK-DNK dupleksleriniň eremegini güýçlendirýär.
Esasy dizaýn
RT-qPCR-de qPCR ädimi üçin ulanylýan PCR primerleri, ekzon-ekson çatrygy üçin iň oňat dizaýn edilmelidir, bu ýerde güýçlendiriji primer hakyky ekson-intron araçägini geçip biler.Içinde saklaýan genom DNK yzygiderliligi güýçlendirilmänsoň, bu dizaýn genom DNK-nyň hapalanmagyndan güýçlendirilen ýalan pozitiw töwekgelçiligini azaldar.
Astarlar ýa-da ekson-ekson araçäklerini bölmek üçin dizaýn edilip bilinmeýän bolsa, genom DNK hapalanmagyny aýyrmak üçin RNK-dan erkin DNase I ýa-da dsDNase bilen RNK nusgalaryny bejermek zerur bolup biler.
RT-qPCR gözegçilik
DNK hapalanmagyny anyklamak üçin (öňki reaksiýalardan genom DNK ýa-da PCR önümleri ýaly) RT-qPCR synaglarynyň hemmesine ters transkripsiýa gözegçilik (-RT gözegçilik) girizilmelidir.Bu gözegçilik ters transkriptazadan başga ähli reaksiýa komponentlerini öz içine alýar.Bu gözegçilik bilen ters transkripsiýa ýüze çykmaýandygy sebäpli, PCR güýçlendirilmegi gözegçilik edilse, DNK-dan hapalanmagy ähtimal.
Iş wagty: Awgust-02-2022
