Adaty ters ýazgylar ýokary temperatura çydap bilmeýär (MMLV işjeňligi üçin iň amatly temperatura 37-50 ° C, AMV bolsa 42-60 ° C).Has çylşyrymly wirus RNK-ny pes temperaturada CDNA-a tersine öwrüp bolmaýar, netijede ýüze çykaryş netijeliligi peselýär.Adaty RT-qPCR, adatça, iki esasy fermentiň (ters transkriptaz we DNK polimeraza) gatnaşmagyny talap edýär, bu bolsa reaksiýa ulgamynyň işini ýönekeýleşdirip we çykdajylary azaltmaga mümkinçilik bermeýär.Bu ýerde iki sany ýokary temperatura çydamly ters transkriptaz, TtH we RevTaq bilen tanyşdyrarys.Bu iki fermentiň DNK polimerazasy hem bar, şonuň üçin olara bifunksional fermentler diýilýär.

TtH DNK polimeraza

Termofil bakteriýasy Termus termofil HB8-den alnan TtH hakda eşiden bolmaly.Mg2 + ýaly bölünen kationlaryň barlygynda, DNK polimeraza işjeňligi bar.Taq fermenti ýaly PCR reaksiýalarynda giňden ulanylýar, ýöne Taq fermentinden has ýokary ýylylyk garşylygy bar, şonuň üçin ýokary GC mazmun şablonlary bolan PCR-de has gowy täsir edýär.

· Bu fermentde esasan 3 ′ → 5 ′ ekzonukleýasiýa işjeňligi we 5 ′ → 3 ′ eksonukleýasiýa işjeňligi ýok, şonuň üçin ol dioksi yzygiderliligi üçin hem ulanylyp bilner.

· Bu fermentiň RTase işjeňligi bar.Mn2 + bar bolsa, RTase işjeňligi güýçlendiriler.Bu aýratynlygy ulanyp, tersine transkripsiýa reaksiýasyny we PCR reaksiýasyny şol bir turbada, ýagny bir basgançakly RT-PCR ýerine ýetirmek üçin ulanyp bolýar.Şeýle-de bolsa, Mn2 + bar bolsa, RT-PCR takyklygy ýokary däl.RT işjeňliginiň rnaase H işjeňligi bilen hiç hili baglanyşygy ýok.

· Tth-DNA polimerazynyň (pH9, optimal + 55 ℃ ～ + 70 ℃, iň ýokary + 95 ℃) işjeňliginiň ýokarlanmagy, RNK ikinji derejeli gurluşy sebäpli ýüze çykan kynçylyklary ýeňip geçýär.Alnan cDNA, Mg2 + ionlarynyň barlygynda şol bir ferment bilen PCR tarapyndan güýçlendirilip bilner.

· Tth-DNK polimerazynyň ýokary temperaturada ters transkripsiýa we DNK güýçlendirmek ukyby bu fermenti mukdarda RT-PCR, klonlaşdyrmak we öýjükli we wirusly RNK-nyň gen aňlatma derňewi üçin peýdaly edýär.
· T-DNA polimeraza, RT-PCR üçin RNK-ny 1kb çenli güýçlendirmek üçin ulanylýar.

Aýratynlyklary we artykmaçlyklary

Üçünji DNK polimeraza:

• Polimeraza zynjyryň optimallaşdyrylan reaksiýasyny (PCR) önümiň ululygyny, RT-PCR reaksiýasynda azyndan 1000 at güýjüne göz ýetiriň

• Üýtgedilen deoksiribonukleozid trifosfaty substrat hökmünde kabul ediň

• RNase H işjeňligi bilen baglanyşykly däl

• Adatça RNK-da bar bolan ýokary derejeli gurluş bilen baglanyşykly meseleleri ýeňip geçmek üçin ýokary ýylylyk durnuklylygy bar

RevTaq RT - PCR DNK polimeraza

Ters transkriptaz işjeňligi bilen ýylylyga çydamly DNK polimeraza

RevTaq-RT-PCR-DNA polimeraza, gönükdirilen we emeli ewolýusiýa arkaly alnan ters transkriptaz we DNK polimeraza işjeňligi bolan in engineenerli, ýokary ýylylyga çydamly, goşa funksional fermentdir.

· RevTaq RT-PCR DNK polimerazynyň 95 ° C-de ýarym ömri 40 minutdan köp.

· RevTaq RT-PCR DNK polimeraza ýokary temperatura ters transkripsiýany gönüden-göni RNK şablonyndan geçirmäge mümkinçilik berýär we ters transkripsiýa ädimini has köp cDNA şablonlaryny döretmek üçin birnäçe gezek gaýtalap bolýar.

· RevTaq RT-PCR DNK polimeraza “nol basgançakly” RT-PCR (izotermiki ters transkripsiýa ädimi ýok) mümkinçilik berýär, sebäbi siklik PCR giňeltmek ädiminde ters transkripsiýa we DNK güýçlendirmek bir wagtda bolup geçýär.Bu, şeýle hem ýokary temperaturada ters transkripsiýa reaksiýasyny öňe sürýär, şeýlelik bilen ýokary temperaturada RNK-da güýçli ikinji derejeli gurluşyň eremeginde ýüze çykýan kynçylyklary azaldýar.

· Aptamer esasly gyzgyn başlangyç formulasy sebäpli, RevTaq RT-PCR DNK polimerazasy, uzalma we uzaldyş temperaturasy 57 ° C-den ýokary bolanda has gowy netijeleri berer.

· Ferment ýylylyga çydamly bolansoň, gaty ýokary eriş nokatlary (> 60 ° C) bilen primerleri we zondlary dizaýn etmek maslahat berilýär.

· Reaksiýa gurmak prosesinde temperatura gradientiniň üsti bilen anneal / uzaldyş ädiminiň temperaturasyny optimizirlemek maslahat berilýär.

· Temperatura näçe ýokary bolsa, PCR-iň aýratynlygy şonça-da ýokarydyr.Tersine transkripsiýa sikli, adatça PCR siklinden has ýokary temperaturada ýerine ýetirilýär, sebäbi DNK Primer: RNA Şablon gibridizasiýasy, adatça DNK Primer: cDNA Template duplex-den has ýokary eriş nokadyna eýe.

· RevTaq RT-PCR DNK polimeraza genetiki taýdan işlenip düzülendir we amplikonyň ululygy 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR DNK polimeraza kesgitleme çäkleri 4 nusga /

Optimallaşdyrylan reaksiýa ulgamy (ýokary eriş nokatlarynyň desgalarynyň döredilmegi) suratda görkezilýär.RevTaq RT-PCR DNK polimeraza bilen dolandyrylýan RT-PCR, TaqPath 1 basgançakly RT-qPCR ussat garyndysyndan we has pes kesgitleme Sample dilution gradientinden has gowy duýgurlygy görkezýär.

Has artykmaçlyklary:

Çalt başlangyç funksiýasy initial Başlangyç ýylylyk denaturasiýa ädimini geçip bolýar.

Gyzgyn başlangyç aptamer formulasy immediately 100% ferment işjeňligini derrew üpjün ediň we pes temperaturada (<57 ° C) güýçlendirilmeginiň öňüni alyň.

Aýyrmak funksiýasy → RNK çykarmak ädimi goýulmady, sebäbi RevTaq RT-PCR DNK polimeraza çig reaksiýa nusgalaryny hem işläp biler.Gyzgyn RT-PCR siklinde eukariotlaryň, bakteriýalaryň we wiruslaryň öýjük membranalaryny derrew ýok edip biler.

IVD çig mal derejesi → ýokary hilli standartlar we aşa bäsdeşlik bahalary