Laboratoriýada täze bir zat hökmünde, pes öwrüliş tizligi bolan bir topar ösümlikden oňyn ösümlikleri barlamak gowy iş däl.Ilki bilen köp sanly nusgadan DNK çykarmaly, soň bolsa daşary ýurt genleri PCR tarapyndan tapylar.Şeýle-de bolsa, netijeler köplenç birnäçe zatlar bilen boş we zolakly bolýar, ýöne ýitirilen tapyndylaryň ýa-da ýalňyş tapyndylaryň bardygyny anyklamak mümkin däl..Şeýle synag prosesi we netijeleri bilen ýüzbe-ýüz bolmak gaty ejizmi?Alada etme, dogan transgen polo positiveitel ösümlikleri aňsat we takyk barlamagy öwredýär.

1-nji ädim

Dizaýn kesgitleýiş desgalary

Synag ediljek nusga laýyklykda kesgitlenmeli endogen genini we ekzogen genini kesgitläň we deslapky dizaýn üçin gende 100-500bp yzygiderliligi saýlaň.Gowy desgalar ýüze çykaryş netijeleriniň takyklygyny üpjün edip, ýüze çykaryş wagtyny gysgaldyp biler (köplenç ulanylýan kesgitleýiş desgalarynyň goşundysyna serediň).

Üns beriň: Täze döredilen desgalar reaksiýa şertlerini optimizirlemeli we uly göwrümli ýüze çykarylmazdan ozal kesgitlemegiň takyklygyny, takyklygyny we kesgitleme çägini barlamaly.

2-nji ädim

Synag teswirnamasyny düzüň

Oňyn gözegçilik: PCR reaksiýa ulgamynyň we şertleriniň kadalydygyny ýa-da ýokdugyny kesgitlemek üçin maksat bölegi bolan arassalanan DNK-ny şablon hökmünde ulanyň.

Ativearamaz / boş gözegçilik: PCR ulgamynda hapalanma çeşmesiniň bardygyny ýa-da ýokdugyny anyklamak üçin maksat bölekini şablon hökmünde öz içine almaýan DNK şablonyny ýa-da ddH2O ulanyň.

Içerki salgylanma gözegçiligi: şablonyň PCR tarapyndan tapylyp bilinjekdigini barlamak üçin nusganyň endogen geniniň primer / zond kombinasiýasyny ulanyň.

Bellik:

Synag netijeleriniň dogrulygyna baha bermek üçin her synag üçin oňyn, otrisatel / boş dolandyryşlar we içerki gözegçilik dolandyryşlary kesgitlenmeli.

Synag taýýarlygy

Ulanylmazdan ozal, çözgüdiň deň derejede garylandygyna göz aýlaň.Ygalyň tapylmagy bilen, ulanmazdan ozal görkezmelere laýyklykda eritmeli we garylmaly.2 × PCR garyndysy, deň däl ion paýlanmazlygy üçin ulanmazdan ozal turba çekmeli we mikropipetta bilen birnäçe gezek garylmaly.

Bellik:

Gollanmany çykaryň we üns bilen okaň we gollanmanyň talaplaryna laýyklykda synagdan öň taýýarlyk görüň.

4-nji ädim

PCR reaksiýa ulgamyny taýýarlaň

Synag teswirnamasyna laýyklykda, H2O we 2 × PCR primerleri deň derejede garyşdyryň, sentrifuga we her reaksiýa turbasyna paýlaň.

Bellik:

Uly göwrümli ýa-da uzak möhletli synag üçin, PCR önümleri sebäpli ýüze çykýan aerozol hapalanmagynyň öňüni alyp biljek UNG fermentini öz içine alýan PCR reaksiýa ulgamyny ulanmak maslahat berilýär.

5-nji ädim

Reaksiýa şablonyny goşuň

Göni PCR tehnologiýasyny ulanyp, ýadaw nuklein kislotasyny arassalamak zerurlygy ýok, nusga şablony 10 minudyň içinde taýýarlanyp bilner we degişli PCR reaksiýa ulgamy goşulyp bilner.

Bellik:

Arylmak usuly has gowy kesgitleme täsirine eýe we alnan önüm köp ýüze çykaryş reaksiýalary üçin ulanylyp bilner.

5.1: leavesapraklaryň göni giňelmegi

Gollanmadaky suratyň ululygyna görä, diametri 2-3 mm bolan ýaprak dokumasyny kesiň we PCR reaksiýa ulgamyna ýerleşdiriň.

Bellik: leafaprak bölekleriniň PCR reaksiýa erginine doly çümdürilendigine göz ýetiriň we aşa ýaprak dokumalaryny goşmaň.

5.2: Leafapragy bölmek usuly

-7aprak dokumasyny diametri 5-7mm bilen kesip, merkezden gaçyryş turbasyna ýerleşdiriň.Matureetişen ýapraklary saýlasaňyz, ýapragyň esasy damarlarynyň dokumalaryny ulanmagyňyzy haýyş edýäris.Pipette 50ul Buffer P1 lizat, lizatyň ýaprak dokumasyny doly çümdürip biljekdigini, termiki welosipedde ýa-da demir hammamda ýerleşdirip biljekdigini we 95 ° C derejesinde 5-10 minutlap lizat edip biljekdigini üpjün etmek üçin merkezden gaçyryş turbasyna lizat edýär.

50ul Buffer P2 zyýansyzlandyryş erginini goşuň we gowy garmaly.Alnan lizat şablon hökmünde ulanylyp, PCR reaksiýa ulgamyna goşulyp bilner.

Bellik: Şablonyň mukdary PCR ulgamynyň 5-10% arasynda bolup, 20% -den geçmeli däldir (mysal üçin, 20μl PCR ulgamynda 1-2μl liz erginini goşuň, 4μl-den köp bolmaly däl).

6-njy ädim

PCR reaksiýasy

PCR reaksiýa turbasyny merkezden gaçyrandan soň, güýçlendirmek üçin PCR guralyna ýerleşdirilýär.

Bellik:

Reaksiýa güýçlendirmek üçin arassalanmadyk şablony ulanýar, şonuň üçin güýçlendirme siklleriniň sany arassalanan DNK şablonyny ulananyňdan 5-10 köp sikl.

7-nji ädim

Elektroforezi ýüze çykarmak we netijeleriň derňewi

Mugallym: 100bp DNK merdiwan

1 \ 4: Arassalanan DNK usuly

2 \ 5: Göni PCR usuly

3 \ 6: Boş gözegçilik

S:

Synagda goýlan dürli gözegçilikleriň synag netijeleri aşakdaky şertlere laýyk gelmelidir.Otherwiseogsam, meseläniň sebäbini seljermeli we mesele ýok edilenden soň synag täzeden geçirilmeli.

Tablisa 1. Dürli gözegçilik toparlarynyň adaty synag netijeleri

* Plazmid polo positiveitel gözegçilik hökmünde ulanylanda, endogen gen synagynyň netijesi negatiw bolup biler

Netije hökümi:

A. Nusganyň endogen geniniň synag netijesi otrisatel bolup, adaty PCR kesgitlemek üçin laýyk DNK-nyň nusgadan çykarylyp bilinmejekdigini ýa-da çykarylan DNK-da PCR reaksiýa ingibitorlarynyň bardygyny we DNK gaýtadan çykarylmalydygyny görkezýär.

B. Nusganyň endogen geniniň synag netijesi polo positiveitel, ekzogen geniň synag netijesi otrisatel bolup, adaty PCR kesgitlemek üçin DNK-nyň nusgadan çykarylandygyny görkezýär we nusgada XXX geniniň tapylmandygyny kesgitläp bolýar.

C. Nusganyň endogen geniniň synag netijesi polo isitel, ekzogen geniň synag netijesi polo isitel bolup, adaty PCR kesgitlemek üçin DNK-nyň nusgadan çykarylandygyny we DNK nusgasynda XXX geniniň bardygyny görkezýär.Tassyklama synaglary mundan beýläk hem geçirilip bilner.

8-nji ädim

Dizaýn kesgitleýiş desgalary

Synagdan soň, daşky gurşawyň hapalanmagynyň öňüni almak üçin synag meýdançasyny süpürmek üçin 2% natriý gipohlorit erginini we 70% etanol erginini ulanyň。