PCR iň köp ulanylýan nuklein kislotasyny güýçlendirmek tehnologiýasy bolup, duýgurlygy we aýratynlygy sebäpli giňden ulanylýar.Şeýle-de bolsa, PCR yzygiderli ýylylyk denaturasiýasyny talap edýär we kliniki meýdan synaglarynda ulanylmagyny çäklendirýän gurallara we enjamlara bil baglamak çäklendirmelerinden dynyp bilmeýär.

1990-njy ýyllaryň başyndan bäri köp laboratoriýa ýylylyk denaturasiýasyny talap etmeýän hemişelik temperaturany güýçlendirmek tehnologiýasyny ösdürip başlady.Indi olar aýlawly izotermiki güýçlendirme tehnologiýasyny, ýüpi çalyşmak izotermiki güýçlendiriş tehnologiýasyny, tegelek izotermiki güýçlendiriş tehnologiýasyny we nuklein kislotasynyň yzygiderliligine garaşlylygy ösdürdiler.Izotermiki güýçlendirme tehnologiýasy we beýleki tehnologiýalar. 

Loop-ara izotermiki güýçlendirme

Güýçlendirmek ýörelgesi DNK-nyň takmynan 65 ° C derejesinde dinamiki deňagramlylyk ýagdaýynda bolmagyna esaslanýar.Haçan-da haýsydyr bir primer esasy jübütlenen we iki hatar DNK-nyň goşmaça bölegine çenli uzalsa, beýleki zolak bölünip, bir hatar bolar.

Bu temperaturada, DNK yzygiderli üýtgeýän DNK polimeraza bil baglamak üçin 4 sany ýörite primer ulanýar.

Ilki bilen maksatly gen boýunça F3, F2, F1, B1, B2, B3 6 aýratyn sebiti kesgitläň, soňra bolsa bu 6 aýratyn sebitiň esasynda 4 aşaky desgany düzüň (aşakdaky suratda görkezilişi ýaly):

Öňdäki içki asma (FIP) F1c we F2-den durýar.

Yza çekilen içki primer (BIP) B1c we B2-den, TTTT ortada boşluk hökmünde ulanylýar.

Daşarky primerler F3 we B3 degişlilikde maksatly gendäki F3 we B3 sebitlerinden durýar.

LAMP reaksiýa ulgamynda içki primeriň konsentrasiýasy daşky primeriňkiden birnäçe esse köpdür.Içki asma ilki bilen DNK goşa hatary emele getirmek üçin goşmaça ýüpi sintez etmek üçin şablon ýüpi bilen birleşdirilýär.Netijede, daşky primer şablon ýüpi bilen birleşdirilip, DNK goşa ýüpi emele getirýär.BstDNA polimerazynyň täsiri bilen içki primer bilen sintezlenen goşmaça setir çykýar.Birnäçe reaksiýadan soň, biri-biriniň üstüni ýetirýän setir ahyrsoňy dambbell gurluşy bilen ýekeje DNK zolagyny emele getirýär.

Dambbell gurluşy DNK-nyň bir ýüpi, açyk uçly geçişli aýlawly DNK-ny yzygiderli emele getirmek üçin şablon hökmünde ulanylýar.Içki we daşarky desgalar geçiş sap-aýlaw gurluşy DNK-ny yzygiderli süýşmek we uzaltmak reaksiýalaryna ýol açýar we ahyrynda dürli uzynlykdaky köp aýlawly gurluşlary emele getirýär.DNK garyndysy.

Aýlawly izotermiki güýçlendirişiň artykmaçlyklary we kemçilikleri

LAMP-iň artykmaçlyklary:

.

(2) Reaksiýa wagty gysga, aýratynlygy güýçli we ýörite enjam gerek däl.

LAMP-iň kemçilikleri:

(1) Astarlara bildirilýän talaplar aýratyn ýokary.

(2) Güýçlendirilen önüm klonlaşdyrmak we yzygiderlilik üçin ulanylyp bilinmez, diňe höküm üçin ulanylyp bilner.

(3) Güýçli duýgurlygy sebäpli aerozollary emele getirmek, ýalan pozitiwlere sebäp bolmak we synag netijelerine täsir etmek aňsat.

Strand süýşmesini güýçlendirmek

Göçme süýşmegi güýçlendirmek (SDA) 1992-nji ýylda Amerikaly alym Walker tarapyndan ilkinji gezek teklip edilen ferment reaksiýasyna esaslanýan in vitro izotermiki DNK güýçlendirmek usulydyr.

SDA-nyň esasy ulgamy çäklendiriji endonukleýz, süýüm süýşmesi işjeňligi bolan DNK polimeraza, iki jübüt primer, dNTP, kalsiý we magniý ionlary we bufer ulgamlaryny öz içine alýar.

Setir süýşmesini güýçlendirmek prinsipi, DNK-nyň iki ujunda himiki taýdan üýtgedilen çäklendirme endonukleýz tanamak yzygiderliligine esaslanýar.Endonukleýz, tanalýan ýerdäki DNK-daky boşlugy açýar we DNK polimeraza 3 ′ boşlugy uzaldýar we indiki DNK zolagyny çalyşýar.

Çalyşan DNK hatarlary primerler bilen birleşdirilip, DNK polimeraza bilen iki hatara uzalyp bilner.Maksat yzygiderliligi netijeli güýçlendirilmegi üçin bu amal yzygiderli gaýtalanýar.

Setli süýşmegi güýçlendirmek tehnologiýasynyň artykmaçlyklary we kemçilikleri

SDA-nyň artykmaçlyklary:

Güýçlendirmek netijeliligi ýokary, reaksiýa wagty gysga, aýratynlygy güýçli we ýörite enjam gerek däl.

SDA-nyň kemçilikleri:

Önümler birmeňzeş däl we käbir bir hatar we iki hatar önümler elmydama SDA siklinde öndürilýär we elektroforez ýüze çykarylanda guýruk hökmany suratda ýüze çykýar.

Rolling tegelegi güýçlendirmek

Rolling tegelegi güýçlendirmek (RCA), tegelek tegelek arkaly patogen organizmlerden DNK-ny göçürmegiň usulyny çekmek arkaly teklip edilýär.Bir hatar tegelek DNK-ny hemişelik temperaturada şablon hökmünde we maksatly geniň güýçlendirilmegine ýetmek üçin tegelek DNK sinteziniň täsiri astynda ýörite DNK polimerazyny (Phi29 ýaly) ulanmagy aňladýar.

RCA çyzykly güýçlendirme we ekspensial güýçlendirme diýip bölünip bilner.Çyzykly RCA-nyň netijeliligi 10-a ýetip biler⁵gezek, we ekspensial RCA-nyň netijeliligi 10-a ýetip biler⁹gezek.

Pleönekeý tapawut, aşakdaky suratda görkezilişi ýaly, çyzykly güýçlendirme diňe 1 primer ulanýar, ekspensial güýçlendirme b-de 2 sany primer bar.

Çyzykly RCA ýekeje primer RCA hem diýilýär.Astar tegelek DNK bilen baglanyşýar we DNK polimerazynyň täsiri bilen uzalýar.Önüm, bir aýlawyň uzynlygyndan müňlerçe esse köp gaýtalanýan yzygiderlilikli çyzykly bir setir.

Çyzykly RCA-nyň önümi elmydama başlangyç başlangyç bilen baglanyşykly bolansoň, signalyň aňsat kesgitlenmegi esasy artykmaçlykdyr.

Eksonensial RCA, Hyper şahaly güýçlendirme HRCA (Hyper dallanan RCA) diýlip hem atlandyrylýar, ekspensial RCA-da bir primer RCA önümini güýçlendirýär, ikinji primer RCA önümi bilen gibridlenýär we uzalýar, çalyşmak eýýäm RCA önümi bilen baglanyşdyrylýar Aşakdaky desgalar dendrit RCA güýçlendirmek önümini öndürmek üçin uzalýar we çalşylýar.

Tegelek nuklein kislotasynyň güýçlendirilmeginiň artykmaçlyklary we kemçilikleri

RCA-nyň artykmaçlyklary:

Highokary duýgurlyk, gowy aýratynlyk we aňsat işlemek.

RCA-nyň kemçilikleri:

Signal ýüze çykarylanda fon problemalary.RCA reaksiýasy wagtynda, sirkirlenmedik gulp zondy we birikdirilmedik zondyň DNK ýa-da RNK şablony käbir fon signallaryny döredip biler. 

Nucleicacid yzygiderliligine esaslanýan güýçlendirme

Nuklein kislotasynyň yzygiderliligine esaslanýan güýçlendirme (NASBA) PCR esasynda işlenip düzülen täze tehnologiýa.T7 promouter yzygiderliligi bilen jübüt primer tarapyndan dolandyrylýan üznüksiz we izotermiki nuklein kislotasynyň güýçlendirilmegi.Tehnologiýa, adaty PCR usulyndan 1000 esse ýokary we ýörite enjam talap etmeýän takmynan 2 sagatda RNK şablonyny takmynan 109 esse güýçlendirip biler.

Bu tehnologiýa keselleri ýüze çykan badyna çalt anyklamak üçin ulanyldy we häzirki wagtda köp kompaniýalar bu usuly RNK kesgitlemek enjamlarynda ulanýarlar.

RNK güýçlendirmek ters transkripsiýa PCR tehnologiýasyny hem ulanyp bilse-de, NASBA-nyň öz artykmaçlyklary bar: deňeşdirilende hemişelik temperatura şertlerinde amala aşyrylyp bilner we adaty PCR tehnologiýasyndan has durnukly we takyk.

Reaksiýa 41 dereje Selsiýada bolup, AMV (guş miýeloblastoz wirusy) ters transkriptaz, RNase H, T7 RNA polimeraza we bir jübüt primer talap edýär.

Bu proses esasan aşakdakylary öz içine alýar:

Öňe sürülýän deslapky T7 promouteriniň goşmaça yzygiderliligini öz içine alýar.Reaksiýa wagtynda öňe çykarylýan desga RNK zolagy bilen baglanyşýar we AMV fermenti bilen katalizlenip, DNK-RNA goşa hatary emele getirýär.

RNase H gibrid iki hatar RNK-ny siňdirýär we bir hatar DNK-ny saklaýar.

Ters primeriň we AMV fermentiniň täsiri bilen, T7 promouter yzygiderliligini öz içine alýan DNK goşa zolak emele gelýär.

T7 RNA polimerazynyň täsiri astynda transkripsiýa prosesi tamamlanýar we köp mukdarda maksatly RNK öndürilýär.

NASBA-nyň artykmaçlyklary:

.

(2) NASBA ters transkripsiýa prosesini güýçlendirme reaksiýasyna gönüden-göni goşýar, reaksiýanyň wagtyny gysgaldýar.

NASBA-nyň kemçilikleri:

(1) Reaksiýa komponentleri has çylşyrymly.

(2) Reaksiýanyň bahasyny has ýokary etmek üçin üç görnüşli ferment talap edilýär.