1. RNK ergininiň siňdirilişini kesgitläň
280, 320, 230 we 260 nm aralygyndaky siňdiriş, degişlilikde nuklein kislotasynyň, fon (ergin bulaşyklygy), duz konsentrasiýasy we belok ýaly organiki maddalaryň bahalaryny görkezýär.Adatça diňe OD260 / OD280 serediň (gatnaşygy, R).1.8 ~ 2.0 bolanda, RNK-da beloklaryň ýa-da beýleki organiki maddalaryň hapalanmagyna ýol berilip bilner diýip pikir edýäris, ýöne Tris siňdirişi kesgitlemek üçin bufer hökmünde ulanylanda, R bahasynyň 2-den uly bolup biljekdigini bellemelidiris (umuman <2.2 bolmaly).R <1.8 bolanda, ergindäki belogyň ýa-da beýleki organiki maddalaryň hapalanmagy has aýdyň bolýar we RNK-nyň ykbaly zerurlyklara görä kesgitlenip bilner.R> 2.2 bolanda, RNK-nyň ýeke nuklein kislotasyna gidrolizlenendigini aňladýar.
2. RNK-nyň elektroforetiki nagşy
Adatça, denatirleme jeli RNK elektroforezi üçin ulanylýar, ýöne diňe RNK-nyň hilini kesgitlemek üçin bolsa, denatirleme jeli zerur däl we adaty agarose jeli ulanylyp bilner.Elektroforeziň maksady, 28S we 18S zolaklaryň bitewiligini we olaryň gatnaşygyny ýa-da mRNA ýuwmagyň bitewiligini kesgitlemekdir.Umuman alanyňda, 28S we 18S zolaklary açyk, düşnükli we ýiti bolsa (zolaklaryň gyralaryna salgylanýar) we 28S-iň ýagtylygy 18S toparynyňkydan iki esse köp bolsa, RNK-nyň hilini gowy hasaplaýarys.
Aboveokardakylar köplenç ulanýan iki usulymyz, ýöne bu iki usulyň hiç biri-de RNK ergininde galyndy RNase bardygyny ýa-da ýokdugyny anyk aýdyp bilmez.Çözüwde RNase gaty az bolsa, ony ýokardaky usul bilen kesgitlemek kyn, ýöne soňraky ferment reaksiýalarynyň köpüsi 37 derejeden ýokary we uzak wagtlap amala aşyrylýar.Şeýlelik bilen, RNK ergininde RNase gaty az bolsa, indiki synaglarda rol oýnamak üçin gaty amatly gurşaw we wagt bolar we elbetde synag şu wagt sowuk bolar.Aşakda RNK ergininde galyndy RNase bardygyny ýa-da ýokdugyny tassyklaýan usul hödürleýäris.
3. atylylygy goramak synagy
Nusga konsentrasiýasyna görä, RNK ergininden iki 1000 ng RNK çekip, ony 0,5 ml sentrifuga turbasyna goşuň we pH 7.0 Tris buferi bilen umumy göwrümine 10 ul goşuň we turbanyň gapagyny möhürläň.Olardan birini 70 ° C-de hemişelik temperaturaly suw wannasyna salyň we 1 sagat ýyly saklaň.Beýleki bölegi -20 ° C sowadyjyda 1 sagada saklandy.Wagt gutaransoň, elektroforez üçin iki nusgany aýyryň.Elektroforez gutarandan soň, ikisiniň elektroforetiki zolaklaryny deňeşdiriň.Ikisiniň zolaklary yzygiderli bolsa ýa-da düýpli tapawudy ýok bolsa (elbetde, olaryň zolaklary hem 2-nji usuldaky şertlere laýyk gelýär), bu RNK ergininde galyndy RNase hapalanmagynyň ýokdugyny we RNK-nyň hili gaty gowydygyny aňladýar.Munuň tersine, 70 ° C inkubasiýa edilen nusga aç-açan zaýalanmagy görkezýän bolsa, RNK ergininde RNase hapalanmagynyň bardygyny görkezýär.
2 RNK çykarmak üçin synag usullary we usullary
RNK çykarylanda köplenç duş gelýän meselelerimiz: (1) RNK hasyllylygy pes;(2) RNK duzuň çynlakaý hapalanmagy;(3) RNK-da organiki erginleriň çynlakaý hapalanmagy bar;(4) zaýalanmak we beýleki meseleler
1. Köplenç ulanylýan RNK çykarmak reagentleri
Guanidin izotiosýanat usuly we Trizol usuly haýwan dokumalaryndan we haýwan öýjüklerinden jemi RNK çykarmak üçin iň köp ulanylýan usuldyr.Aýratynam, towşan derisinden we haýwanlaryň birleşdiriji dokumasyndan umumy RNK çykarmak ýaly ownuk nusgalar we dokumalar üçin has amatlydyr;Mundan başga-da, Trizol, umumy maksatly liz reagenti hökmünde ösümlik dokumalaryny, bakteriýalary, kömelekleri we beýleki dokumalary çykarmak üçin hem ulanylyp bilner.Kamelýa oleifera, çaý ýapraklary, rezin we ş.m. ýaly polisakaridleri we polifenollary öz içine alýan ösümlik dokumalary üçin umumy RNK çykarmak üçin CTAB usuly hem ulanylyp bilner.
Adaty usul hökmünde goşa sütün usuly, adaty temperatura işleýşi, RNase goşmagyň zerurlygy we howpsuzlygy üçin - hloroform, fenollar we beýleki organiki reagentler sebäpli gaty meşhurdyr.(maslahat berilýän önümler )
2. Haýwan dokumalaryndan jemi RNK çykarmak
.
(2) Dokumanyň ownuk bölegini kesmek üçin arassa gaýçy we jüpdek ulanyň, nusga kesilende dokumanyň merkezi bölegini kesmäge synanyşyň ýa-da ilki bilen dokumanyň uly bölegini ortadan kesiň, soňra bolsa nusgany täze kesilen ýagdaýda kesiň.Aýyrylan dokumalar doly kesilmeli, kesilen dokumalary RNase bolmazdan EP turbasyna salmaly, lizat goşmaly, kesilen dokumalar lizata doly täsir etmeli we birmeňzeşlige taýyn bolmaly.
(3) Adaty dokumalar üçin gomogenizasiýa üçin kömelek noýba ölçegli dokumalary (30-60 mg) saýlaň.Dokumalarda köp mukdarda belok, ýag ýa-da bagyr ýaly dykyz süýümli dokumalar bar bolsa, kesilen dokumalaryň mukdaryny degişli derejede köpeldiň ýa-da azaldyň (islege görä) 10 ~ 20 mg saýlaň).
(4) Balyk myşsasy, gysga et, meduza we suwuň köp mukdary bolan beýleki dokumalar çykarylsa, nusganyň göwrümi degişli derejede ýokarlandyrylmalydyr (100-200 mg maslahat berilýär).
(5) Şertler rugsat berse, haýwan dokumasy ýokary enjamly dokuma gomogenizatory bilen birleşdirilenden soň gönüden-göni çykarylyp bilner, eger şeýle enjam ýok bolsa.
(6) Iň soňky çykarylandan soň alnan RNK, derrew RNK-nyň zaýalanmagyny azaltmak üçin buz gutusyna goýulmalydyr.
3. Haýwan öýjükleriniň RNK çykarylyşy
(1) Asma öýjükleri: sentrifugany gönüden-göni taşlaň we steril PBS bilen 1-2 gezek ýuwuň, soňra degişli mukdarda PBS bilen saklaň we liz üçin lizat goşuň.Suwuklygy doly taşlandan soň lizaty göni çökdürilen öýjüklere goşmaň.Bu, daşky gatlakdaky lizirlenen öýjüklerden soň çykan giston paketiniň çökdürilen öýjükleriň daşyna ýapyşmagyna sebäp bolar we şeýlelik bilen pelletiň içindäki öýjükleriň lizat bilen baglanyşygyny çäklendirer., öýjük lizisiniň doly bolmazlygyna we RNK hasyllylygynyň peselmegine getirýär.
.Gazyp almak üçin fermentiň EP turbasyna lizat goşuň.
.
4. Ösümlik RNK çykarmak
Ösümlik dokumalary fenolik birleşmelere ýa-da polisakaridlere baý, ýa-da belli bolmadyk ikinji derejeli metabolitleri öz içine alýar ýa-da RNase-iň ýokary işjeňligine eýe.Bu maddalar öýjük lizisinden soň RNK bilen berk birleşdirilip, aýrylmagy kyn bolan eräp bilmeýän toplumlary ýa-da kolloid çökündileri emele getirýär.Şonuň üçin ösümlik dokumalaryny çykaranymyzda ösümlikler üçin toplum saýlamalydyrys.Kitapdaky lizat polifenollaryň aňsat okislenmegi we polisakarid birleşmeleriniň we nuklein kislotalaryň bölünmegi meselesini netijeli çözüp biler.
(Polisakarid polifenol ösümligi RNK çykarmak üçin maslahat berilýän önümler:
(1) Ösümligiň gabygy, sogan, tohum, ýaprak we ş.m. doly howada bolmaly.Öwürmek prosesinde, nusganyň eremezligi üçin suwuk azot wagtynda doldurylmalydyr.Sampleer nusgasy lizata çalt goşulmaly we RNK zaýalanmazlygy üçin silkilmeli.
(2) Tüwi we bugdaý ýapraklary ýaly süýüme baý nusgalar üçin çykarylyş mukdary degişli derejede azaldylmalydyr, ýogsam dokumanyň üweýşi we lizisi doly bolmaz, netijede çykarylan RNK-nyň pes hasyly bolar.
(3) Nar miwesi, garpyz miwesi, şetdaly miwesi we ş.m. ýaly suwy köp bolan ösümlik dokumalary üçin nusganyň göwrümi degişli derejede ýokarlandyrylmalydyr (100-200 mg hökmany däl).
.Adaty dokuma gomogenizatorlary ösümlik dokumalaryny birleşdirmekde täsirli bolup bilmez we adatça maslahat berilmeýär.
5. RNK çykarmak üçin seresaplyklar
(1) Dokma nusgalary gaýta doňmakdan we eremezlik üçin mümkin boldugyça täze bolmaly.
(2) Dokma çykarylanda doly ýer bolmaly we dokumanyň mukdary gaty az bolmaly däldir, gaty köp bolsun.
(3) Nusgany doly lizlemek üçin lizat goşandan soň ýeterlik inkubasiýa wagty berilmelidir.
4.
(5) hinguwlanda, ýuwujy suwuklyk doly ýuwulmagyny üpjün etmek üçin turba diwaryna doly aralaşmalydyr.
(6) Sütüni çykarmak usuly üçin, ýuwulandan soň sütüni bölmekden başga-da, adsorbsion sütüni aşa arassa skameýkada goýulmaly we organiki erginçini guraklyga doly bugarmak üçin 5-10 minutlap üflenmeli.
7Adaty Trizol ýarylmagy we izopropanol ýagyş usulynda iň soňky RNK DEPC suwunda ereýär, şonuň üçin dargamak üçin degişli wagt berilmeli we sentrifuga turbasynyň aşagy turbanyň ujy bilen yzygiderli üflenmeli.
3 T.hree RNK pes konsentrasiýasynyň sebäpleri we çözgütleri
1. Hasyl gaty pes
Çykarylan nusga gaty pes, umumy mukdary ýeterlik däl ýa-da alnan nusga gaty köp we liz doly däl;çykarmak üçin degişli hilli dokuma ýa-da öýjükler ulanylmaly, nusganyň öňünden bejergisi gowy edilmeli we liz ýeterlik bolmaly.
2. Genom galyndylary
Trizol usuly bilen çykarylanda, adatdan daşary tebigat gatlakdan soň orta gatlaga siňdirilende, genleriň çynlakaý hapalanmagyna sebäp bolar;orta gatlaga siňmezlik üçin gatlak edilende goşmaça üns berilmelidir.Sütün usuly çykarmak üçin ulanylsa, çykarmak üçin DNase I bolan toplum saýlanyp bilner.Membranada ýerleşdirilen nuklein kislotasy DNase I bilen gönüden-göni siňdirilýär, bu bolsa DNK galyndylaryny ep-esli azaldyp biler.
3. RNK zaýalanmagy
Çykarylan nusganyň özi zaýalanmagy ýa-da gazyp almak prosesinde ýüze çykan zaýalanma bolup biler;Mümkin boldugyça RNK çykarmak üçin täze nusgalar ulanylmaly we ýygnanan nusgalar suwuk azotda ýa-da -80 ° C sowadyjyda saklanmalydyr we doňdurmagyň we eremegiň öňüni almaly.RNK çykarmak işinde RNase / DNase mugt maslahatlar, sentrifuga turbalary we beýleki materiallar ulanylmaly.Gazyp almak prosesi mümkin boldugyça çalt bolmaly.Çykarylan RNK buz gutusyna ýerleşdirilmelidir we wagtynda -80 wagtynda saklanmalydyr.Çykarylan RNK gel elektroforezi bilen ýüze çykarylmaly bolsa, elektroforez çykarylandan soň derrew ýerine ýetirilmelidir we elektroforez buferi täze taýýarlanan bilen çalşylmalydyr.
4. Duz we organiki ergin galyndylary
Çykaryjy reagentlerde fenol we guanidin duzlary, ýuwujy erginde bolsa etanol bar.Gazyp almak prosesinde lizat doly siňdirilmedi we taşlandy we ýuwujy ergin doly guradylmady.Galyndy duzlar we organiki erginler soňraky ters transkripsiýa we PCR üçin zyýanly.Dürli derejedäki päsgelçilik, şonuň üçin dokma lizaty çykarmak prosesinde doly aýrylmaly we turbanyň daş-töweregindäki diwarlary ýuwmak üçin ýuwmak ýeterlik bolmaly.Mundan başga-da, turba boşadylýar we partladylýar, bu organiki maddalaryň galyndysyny hasam azaldar.
RNK çykarmak barada has giňişleýin maglumat üçin web sahypamyza eýeriň:
has giňişleýin maglumat üçin www.foreivd.com.
Iş wagty: 01-2022-nji dekabry
