• facebook
  • Baglanyşyk
  • youtube

 Floresan mukdar PCR (TaqMan PCR diýlip hem atlandyrylýar, mundan beýläk FQ-PCR diýlip atlandyrylýar) 1995-nji ýylda ABŞ-da PE (Perkin Elmer) tarapyndan işlenip düzülen täze nuklein kislotasynyň mukdar tehnologiýasydyr.Çeýe PCR bilen deňeşdirilende, FQ-PCR mukdar funksiýasyny durmuşa geçirmek üçin köp artykmaçlyga eýe.Bu makala tehnologiýanyň aýratynlyklaryny, ýörelgelerini, usullaryny we ulanylyşyny gysgaça beýan etmekçi.

1 Aýratynlyklar

FQ-PCR diňe bir adaty PCR-iň ýokary duýgurlygyna eýe bolman, eýsem floresan zondlaryň ulanylmagy sebäpli, adaty PCR-iň köp kemçiliklerini ýeňip geçýän mukdar netijelerini almak üçin fotoelektrik geçiriji ulgamyň üsti bilen PCR güýçlendirilende floresan signalyň üýtgemegini gönüden-göni kesgitläp biler, şonuň üçin DNK gibridizasiýasynyň ýokary aýratynlygy we spektroskopiýa tehnologiýasynyň ýokary takyklygy hem bar.

Mysal üçin, umumy PCR önümlerine agarose gel elektroforezi we ultramelewşe ýagtylyk bilen etidium bromid boýagy ýa-da poliakrilamid gel elektroforezi we kümüş reňk bilen gözegçilik edilmelidir.Munuň üçin diňe bir birnäçe gural gerek däl, eýsem wagt we güýç gerek.“Ethidium bromide” ulanylýan tegmiller adam bedeni üçin zyýanly we bu çylşyrymly synag synaglary hapalanmak we ýalan pozitiw mümkinçilikler döredýär.Şeýle-de bolsa, FQ-PCR nusga ýüklenende diňe bir gezek gapagy açmaly we indiki proses PCR-den gaýtadan işlemegi talap etmeýän, adaty PCR amallarynda köp kemçiliklerden gaça durýan doly ýapyk turba operasiýasy.Synag, adatça PE kompaniýasy tarapyndan işlenip düzülen ABI7100 PCR termiki welosipedini ulanýar.

Gural aşakdaky aýratynlyklara eýedir: id Giňişleýin ulanmak: DNK we RNA PCR önümleriniň mukdaryny kesgitlemek, gen aňlatma gözlegleri, patogen tapmak we PCR şertlerini optimizirlemek üçin ulanylyp bilner.Ique Üýtgeşik mukdar ýörelgesi: Floresan bellikli zondlary ulanyp, mukdar maksadyna ýetmek üçin floresan mukdary lazer tolgunmasyndan soň PCR sikli bilen ýygnanar.Working workingokary iş netijeliligi: Gurlan 9600 PCR termiki welosiped, 96 nusganyň awtomatiki we sinhron güýçlendirilmegi we mukdaryny tamamlamak üçin kompýuter 1-den 2 sagada çenli gözegçilik edýär.Gel Gel elektroforezi zerurlygy ýok: Mysallary eritmek we elektroforez etmek zerurlygy ýok, diňe reaksiýa turbasynda anyklamak üçin ýörite barlagdan peýdalanyň.The Turbageçirijide hapalanma ýok: Özboluşly doly ýapyk reaksiýa turbasy we fotoelektrik geçiriji ulgam kabul edildi, şonuň üçin hapalanmak barada alada etmegiň zerurlygy ýok.Results Netijeler köpeldilip bilner: mukdar dinamiki diapazon bäş ululyk derejesine çenli.Şonuň üçin bu tehnologiýa üstünlikli işlenip düzülensoň, köp ylmy gözlegçiler tarapyndan baha berildi we köp ugurlarda ulanyldy.

2 iplesörelgeler we usullar

FQ-PCR-iň iş prinsipi, PCR reaksiýa ulgamyna floresan bellikli zondy goşmak üçin Taq fermentiniň 5 ′ → 3 ′ ekzonukleýasiýa işjeňligini ulanmakdyr.Synag başlangyç yzygiderliligindäki DNK şablony bilen ýörite gibridlenip biler.Synagyň 5′endine floresan zyňyndy geni FAM (6 karboksifluoressein, floresan zyňylyşynyň iň ýokary derejesi 518nm), 3′end bolsa floresan söndüriji topar TAMRA (6-karboksitetrametilrodamin, floresan zyňylyşynyň iň ýokary derejesi 582nm) bilen bellik edilýär, 3-nji gözlegiň dowamlylygy.Synag üýtgemän galanda, söndüriji topar çykýan toparyň floresan zyňylyşyny basýar.Zyňyndy topary söndüriji topardan aýrylandan soň, inhibisiýa ýatyrylýar we optiki dykyzlygy 518nm ýokarlanýar we floresan kesgitleme ulgamy tarapyndan kesgitlenýär. Düzediş tapgyrynda synag DNK şablony bilen gibridlenýär we uzaldyş tapgyrynda Taq fermenti primeriň uzalmagy bilen DNK şablony boýunça hereket edýär.Synag kesilende söndürmek effekti çykýar we floresan signal çykýar.Her gezek şablon göçürilende, floresan signalyň çykmagy bilen bir zond kesilýär.Çykarylan floroforlaryň sany bilen PCR önümleriniň sanynyň arasynda ýeke-täk baglanyşyk barlygy sebäpli, bu usul şablony takyk kesgitlemek üçin ulanylyp bilner.Synag guraly, adatça, PE kompaniýasy tarapyndan işlenip düzülen ABI7100 PCR termiki welosipedini ulanýar we beýleki termiki tigirçiler hem ulanylyp bilner.Synag üçin ABI7700 reaksiýa görnüşli reaksiýa ulgamy ulanylsa, reaksiýa gutarandan soň mukdar netijeleri kompýuter derňewi arkaly gönüden-göni berilip bilner.Beýleki termiki tigir sürýänleri ulanýan bolsaňyz, RQ +, RQ-, △ RQ hasaplamak üçin bir wagtyň özünde reaksiýa turbasyndaky floresan signalyny ölçemek üçin floresan detektoryny ulanmaly.RQ +, nusga turbasynyň floresan zyňyndy toparynyň lýumensensiýa intensiwliginiň söndüriji toparyň lýumensensiýa intensiwligine bolan gatnaşygyny görkezýär, RQ- boş turbadaky ikisiniň gatnaşygyny görkezýär, △ RQ (△ RQ = RQ + -RQ-) PCR gaýtadan işlenenden soň mukdar netijelerini alyp bolýar.Floresan zondlaryň girizilmegi sebäpli synagyň aýratynlygy ep-esli ýokarlanýar.Synagyň dizaýny, adatça, aşakdaky şertlere laýyk gelmelidir: bond Baglanyşyň aýratynlygyny üpjün etmek üçin zondyň uzynlygy 20-40 esas bolmaly.C GC bazalarynyň mazmuny, bir nukleotid yzygiderliliginiň gaýtalanmazlygy üçin 40% bilen 60% arasynda.Hy Gibridleşdirmekden ýa-da primerler bilen gabat gelmekden gaça duruň.The Zond bilen şablonyň arasyndaky baglanyşygyň durnuklylygy, primer bilen şablonyň arasyndaky baglanyşygyň durnuklylygyndan has uly, şonuň üçin zondyň Tm bahasy primeriň Tm bahasyndan azyndan 5 ° C ýokary bolmaly.Mundan başga-da, zondyň konsentrasiýasy, zond bilen şablon yzygiderliliginiň arasyndaky gomologiýa, zondyň we primeriň arasyndaky aralyk synaglaryň netijelerine täsir edýär.

Degişli önümler:

China Lnc-RT Gahryman I (gDNase bilen) (lncRNA-dan birinji hatar cDNA sintezi üçin Super Premiks) Öndüriji we üpjün ediji |Foregene (foreivd.com)

China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman öndüriji we üpjün ediji |Foregene (foreivd.com)


Iş wagty: 15-2021-nji oktýabr